里氏木霉銅代謝相關(guān)基因克隆與功能分析.pdf

1、木霉菌是土壤中普遍存在的習(xí)居菌，在植物病害生物防治和土壤農(nóng)化污染修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用。然而木霉菌在與銅制劑農(nóng)藥協(xié)同防治植物病害、與肥料復(fù)合使用提高作物產(chǎn)量及修復(fù)重金屬污染環(huán)境中，需要具備良好的銅耐受性或吸附性。因此，研究木霉銅代謝相關(guān)基因及其功能，揭示木霉菌耐受、吸附和轉(zhuǎn)運銅的機理，為提高木霉菌在銅脅迫下的防病、修復(fù)環(huán)境效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)，對構(gòu)建高效吸附或高耐受銅的工程菌也具有重要意義。本研究以基因組已測序的里氏木霉（Trichoderm

2、areesei）QM6a為原始菌，克隆銅代謝相關(guān)基因，并通過改進的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)構(gòu)建、篩選高吸附銅的里氏木霉突變株，克隆高吸附銅相關(guān)基因，在遺傳、生物化學(xué)和組學(xué)的尺度上明確其代謝功能和作用機制。主要的研究內(nèi)容如下:
　　 1.高吸附銅突變株的構(gòu)建與篩選
　　 對常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)(ATMT)轉(zhuǎn)化方法進行了改進，建立了一種高效篩選吸附銅突變株的方法。通過該方法，構(gòu)建了1664株突變株，并從中篩選到一株高吸附銅

3、突變株AT01，當(dāng)培養(yǎng)基銅濃度為0.7mM時，AT01銅吸附率達(dá)到12.73mg/g(96.1％)，而野生株(WT)吸附率僅為5.97mg/g(49.6％)。顯微鏡觀察表明，AT01突變株胞內(nèi)液泡數(shù)量明顯多于WT，在銅脅迫下可富集較多的銅離子，胞內(nèi)多余的銅離子儲存在液泡中可減少銅對細(xì)胞的毒性作用，進而提高木霉菌對銅的耐受能力。
　　 2.Tad1基因克隆與功能分析
　　 通過反向PCR擴增獲得的T-DNA插入片段側(cè)翼序列

4、并通過NCBI比對分析后獲得基因Tad1。分析表明，該基因讀碼框含1533bp堿基，無內(nèi)含子，在里氏木霉中為單拷貝，編碼一個510氨基酸的蛋白，屬于COG0420，為酰胺水解酶超家族成員。原核表達(dá)產(chǎn)物純化后，進行酶活測定，結(jié)果表明:以腺嘌呤為底物時，酶活性最高，Km為0.66mM。RNA介導(dǎo)基因沉默和過表達(dá)分析表明:在1mM銅脅迫下，WT、AT01、過表達(dá)子(Ovex-Tad1)及沉默子(RNAi-Tad1)的銅吸附水平分別為7.5、1

5、4.1、12.3及4.9mg/g(P值為0.02，T-test)。在同濃度銅脅迫下，通過熒光定量PCR分析了RNAi-Tad1、Ovex-Tad1及AT01、WT中已知的酵母菌銅代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明:Trace、Trccs、Tratx、Trcox四個基因在Ovex-Tad1和AT01中均上調(diào)表達(dá)，而在RNAi-Tad1中，這些基因表達(dá)水平與野生株無明顯差異。進一步通過HPLC分析WT、AT01、Ovex-Tad1、RNAi-

6、Tad1中可與銅相結(jié)合的次黃嘌呤、黃嘌呤產(chǎn)生水平，發(fā)現(xiàn)與WT相比，Ovex-Tad1和AT01中兩種次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生均明顯增加，而RNAi-Tad1產(chǎn)量低于野生株。上述研究從遺傳和生化水平上說明該基因參與里氏木霉對銅的吸附過程。
　　 3.Tad1基因?qū)︺~代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用
　　 通過表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了AT01與WT在1mM銅脅迫下基因表達(dá)水平的差異，共獲得624個上調(diào)基因，305個下調(diào)基因。根據(jù)NCB(I)對基

7、因功能的分析，上調(diào)基因共分為22類。其中與銅代謝相關(guān)的基因主要有三類:(1)調(diào)控胞內(nèi)離子平衡的基因。如胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，細(xì)胞器跨膜運輸相關(guān)基因26個(4.2％)，無機離子運輸及代謝相關(guān)基因25個(4.0％)。(2)耐受和解除重金屬毒性作用的相關(guān)基因，如細(xì)胞解除重金屬毒性相關(guān)基因有11個(1.8％);與細(xì)胞耐受脅迫反應(yīng)相關(guān)基因有11個(1.8％);與細(xì)胞壁合成，細(xì)胞器的膜合成相關(guān)基因有8個(1.3％)，這些基因可能參與銅的跨膜運送。對這8個基因進

8、行了基因敲除，結(jié)果表明，其中一個基因被敲除后，菌體在銅脅迫下生長受到抑制，而且銅的吸附能力也低于WT，該基因功能有待進一步研究。(3)腺嘌呤脫氨酶功能及腺嘌呤代謝相關(guān)基因9個(1.4％)。為驗證上述基因的表達(dá)水平，選擇了上述銅代謝及腺嘌呤代謝相關(guān)基因中差異最顯著的8個基因進行RT-PCR分析:①鐵氧化酶蛋白(Fet3p)，催化二個鐵氧化成三價鐵，1分子該酶需要4分子銅作為輔基。酵母菌研究表明，胞外銅離子濃度變化對該酶活性有明顯影響。②谷

9、胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，廣泛分布于生物體內(nèi)具多種功能的超家族酶，是真菌胞內(nèi)非常重要的銅解毒肽類物質(zhì)。主要催化谷胱甘肽(GSH)的結(jié)合反應(yīng)。③細(xì)胞色素C氧化酶，存在線粒體內(nèi)膜，是細(xì)胞呼吸鏈中非常關(guān)鍵的一個酶，在動物細(xì)胞凋亡過程起重要作用。該酶催化功能需要銅離子作為輔基。④Cccs同源蛋白。Cccs蛋白是酵母細(xì)胞內(nèi)小分子多肽，主要功能是負(fù)責(zé)將胞內(nèi)銅離子運送到SOD酶（超氧化物歧化酶）。與胞內(nèi)銅解毒功能密切相關(guān)。⑤Tctr2基因，編碼一個Ctr2同源基

10、因，該基因在釀酒酵母中與亞銅離子液泡儲存相關(guān)。⑥尿囊素酶基因，該基因催化尿囊素轉(zhuǎn)變成尿囊酸，為腺嘌呤分解代謝下游關(guān)鍵酶。⑦磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶屬于腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個酶，催化磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)變?yōu)?(')單磷酸鹽肌苷(IMP)。⑧GTP（三磷酸鳥苷）環(huán)水解酶，催化GTP水解為單磷酸黃苷，腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個酶。結(jié)果表明，與野生株相比，這些基因在過表達(dá)子和AT01中表達(dá)水平都比野生株提高2倍以上。
　

11、　 4.胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運相關(guān)基因克隆及功能分析
　　 首次在里氏木霉菌中克隆并驗證6個銅代謝調(diào)控因子及功能基因:Tmac1、Trace、Tctr3、Trccs、Tratx、Trcox。其中Tmac1與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Mac1蛋白同源，胞內(nèi)高親和銅轉(zhuǎn)運調(diào)控因子;Trace與酵母Ace1蛋白同源，控制胞內(nèi)金屬蛋白的表達(dá)，參與胞內(nèi)銅毒性的解毒;Tctr3與酵母跨膜蛋白Ctr3同源，參與銅的跨膜轉(zhuǎn)運

12、;Trccs與酵母Ccs1蛋白同源，特異性將銅轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中的抗氧化酶SOD;Tratx與酵母Atx1蛋白同源，能夠與亞銅離子結(jié)合形成二聚體，將其傳遞給高爾基體;Trcox與酵母Cox17蛋白同源，通過兩個中間蛋白因子介導(dǎo)，將亞銅離子傳遞給細(xì)胞色素C氧化酶。進一步研究表明Tmac1基因編碼一個501氨基酸的蛋白。在蛋白C端具兩個Cys-His重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，與銅結(jié)合有關(guān)。敲除該基因后，木霉菌生長緩慢且對銅饑餓敏感，基因回補后，功能得到完全恢

13、復(fù)。將該基因回補到酵母突變株(⊿)Mac1能完全恢復(fù)酵母突變株耐受銅饑餓能力。Trace基因編碼一個含405氨基酸的蛋白，蛋白含4個CXXC結(jié)構(gòu)域，與銅結(jié)合有關(guān)。同時在蛋白N端含銅依賴型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域CVRGHR。酵母回補實驗表明，該基因能夠完全恢復(fù)酵母(⊿)Ace1的功能。Tctr3蛋白含178個氨基酸，具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，N端含保守結(jié)構(gòu)域MLLAM。Trccs、Tratx、Trcox分別編碼三個小分子銅分子伴侶。Trccs編碼24

14、8個氨基酸的蛋白，N端含保守結(jié)構(gòu)域CXXCV，與銅結(jié)合功能相關(guān)酵母胞內(nèi)銅相關(guān)分子伴侶同源。Tratx編碼一條含82氨基酸的蛋白，N端具有保守結(jié)構(gòu)域MTCXXC。Trcox編碼61個氨基酸的蛋白。另外，Trace、Trccs、Tratx、Trcox這四個基因的表達(dá)水平變化可用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度的變化。
　　 綜合上述實驗結(jié)果提出Tad1基因參與木霉菌銅吸附和胞內(nèi)銅代謝可能途徑為:腺嘌呤脫氨酶（Tad1基因編碼）催化木霉胞內(nèi)腺嘌