花生(arachishypogaeal.)蔗糖合成酶基因ahsusy的克隆及功能分析

1、分類號：$ 5 6 5 ．2密 級： 公玨單位代碼：學(xué)號：1 0 0 8 62 0 0 9 2 8 0花生( A r a c h i s h y p o g a e aL ．) 蔗糖合成酶基因A h S u S y 的克隆及功能分析M o l e c u l a r C l o n i n ga n d F u n c t i o n a l A n a l y s i so n S u c r o s eS y n t h a s e

2、G e n e A h S u S y o fP e a n u t ( A r a c h i s h y p o g a e aL ．)學(xué)位申請人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：何美敬劉立峰 教授作物遺傳育種農(nóng)學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二O 一二年五月二十五日I I II I I I I I I I I I I I I I I I IY 2 1 4 3 5 3 2摘要干旱是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子。揭示干旱脅迫下植

3、物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制對于闡明植物的應(yīng)答反應(yīng)及培育耐旱品種具有重要的理論和現(xiàn)實意義。蔗糖合成酶( S u c r o s e S y n t h a s e ， S u S y ) 是蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物生長、發(fā)育和滲透調(diào)節(jié)過程起著重要的作用。本研究利用同源克隆、R A C E 和T A I L ．P C R 相結(jié)合的方法從花生葉片中分離蔗糖合成酶基因A h S u S y ，并對其表達(dá)特性及功能進(jìn)行初步分析，旨在為改善花生

4、耐旱性提供理論依據(jù)，主要研究結(jié)果如F ：1 ．A h S u S y 基因的克隆及序列分析：以擬南芥A t S u S y 序列為探針，通過同源克隆法及R A C E 技術(shù)，從窄葉花生品種中克隆得到了彳^ 鼬s y ( 基因登陸號J F 3 4 6 2 3 3 ) ，A h S u S y 的c D N A 序列全。K 2 ，7 9 0 b p ，包含一個長為2 4 2 1 b p 的開放閱讀框?；ㄉ鶶 u S y 蛋白長度為8 0 6

5、 個氨基酸殘基，分子量約9 2 4 0 2 ．8 D a ，等電點約為6 ．3 1 。序列分析表明，A h S u S y 編碼的氨基酸與大豆、擬南芥等植物中相關(guān)蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)7 5 ％以上，系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)與大豆的親緣關(guān)系最近。2 ．A h S u S y 基因組序列的克隆和序列分析：以花生基因組D N A 為模板，利用染色體步移技術(shù)( G e n o m e W a l k i n g ) 中I 拘T A I L ．P C

6、R 技術(shù)擴(kuò)增A h S u S y 基因組序列和啟動子區(qū)域，得到基因組序Y 0 6 1 8 9 b p 。啟動子預(yù)測分析表明，該序列包含約8 2 5 b p l 舶動子上游調(diào)控序列，1 3 個外顯子，1 2 個內(nèi)含子。啟動子元件分析顯示該片段含有典型的T A T A ．b o x 、C A A T ．b o x ，并存在低溫響應(yīng)元件L T R 、G A n l h J 應(yīng)元件P —b o x 、干旱響應(yīng)M Y B結(jié)合位點M B S 、厭

7、氧誘導(dǎo)必要的順式作用元件A R E 等調(diào)控元件及光響應(yīng)元件G —b o x 、b o x 4 等，說D ) j A h S u S y 的表達(dá)可能受低溫、干旱、缺氧、光照等環(huán)境因素以及激素G A的調(diào)控。3 ．A h S u S y 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)：成功構(gòu)建T p E T 3 2 a - A h S u S y 原核表達(dá)載體，在I P T G 誘導(dǎo)下得到9 2 K D 左右的目的蛋白，與理論值相同。4 ．A h S u S

8、y 基因的表達(dá)特性分析：花生苗期半定量R T - P C R 分析表明正常條件下A h S u S y 在花生根、莖、葉中均有表達(dá)。其中，在根中的表達(dá)豐度最高。利用1 0 ％P E G模擬干旱處理花生幼苗，結(jié)果表明脅迫后么h S u S y 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量、蔗糖合成酶活性和蔗糖含量均在4 h ．1 2 h 逐漸升高，1 2 h ．2 4 h 逐漸降低，推測該基因能夠響應(yīng)干旱脅迫，在花生抗旱調(diào)控中起著一定的作用。關(guān)鍵詞：花生；蔗糖合成酶；干