大豆蔗糖代謝相關(guān)基因GmCInv1和GmSPP1的克隆及功能分析.pdf

1、菜用大豆是一種重要的豆類蔬菜，指處于鼓粒末期（R6-R7）籽粒飽滿，莢和籽粒翠綠色，但籽粒尚未完全成熟的大豆。食味品質(zhì)是菜用大豆的重要品質(zhì)要素，籽粒的蔗糖含量是食味品質(zhì)中的甜味因子。本研究以菜用大豆品種“南農(nóng)菜豆6號(hào)”為材料，克隆了參與蔗糖合成和代謝的兩個(gè)酶的基因GmCInv1和GmSPP1，并對(duì)兩基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行初步分析，旨在了解這些基因?qū)M織中糖分累積及植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.菜用大豆不同組織中

2、蔗糖含量變化
　　隨著大豆籽粒的發(fā)育，籽粒中的蔗糖含量在花后15天(DAF15)到DAF30天是逐漸升高的，DAF30-35天蔗糖含量降低，DAF35-DAF50蔗糖含量升高。。大豆花期根和花等組織中的蔗糖含量較高。
　　2.GmCInv1基因的克隆及序列分析
　　以編碼擬南芥細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因序列為探針，通過電子克隆方法，從菜用大豆中克隆得到編碼大豆細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶GmCInv1基因。序列分析發(fā)現(xiàn)GmCInv1包含一個(gè)長(zhǎng)為

3、1668bp的開放閱讀框，編碼555個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)的分子量是63.20kD。GmCInv1與百脈根細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶Ljinv1氨基酸序列相似性達(dá)到92％。
　　3.GmCInv1基因的表達(dá)模式分析和功能分析
　　利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)GmCInv1基因的組織特異性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，GmCInv1在大豆籽粒的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量不同，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在DAF35天是表達(dá)量最高。GmCInv1在苗期根部和花中的表達(dá)量較高，

4、在莖中表達(dá)量最低。隨著葉片的發(fā)育，葉片初期的GmCIncv1表達(dá)量很低，后期GmCInv1表達(dá)量卻很高。將GmCInv1轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行過表達(dá)分析，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)基因株系糖分組成發(fā)生變化，葉片中蔗糖含量降低，葡萄糖含量升高，但種子蔗糖含量與野生型相比并無顯著差異。轉(zhuǎn)基因GmCInv1擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，蓮座葉數(shù)目增加，開花延遲。過表達(dá)GmCInv1基因擬南芥葉片中的脯氨酸含量顯著升高。
　　4.GmSPP1的克隆及序列分析

5、>　　以編碼擬南芥蔗糖-6-磷酸酯酶1（AtSPP1）為探針，通過電子克隆的方法，從大豆中克隆得到編碼大豆蔗糖-6-磷酸酯酶基因GmSPP1。序列分析表明GmSPP1包含一個(gè)1257bp開放閱讀框，編碼418個(gè)氨基酸，基因編碼的蛋白質(zhì)分子量是47.22kD。GmSPP1在同源性分析中與葡萄SPP氨基酸序列相似性是69％。
　　5.GmSPP1基因的表達(dá)模式分析和功能分析
　　隨著大豆籽粒的發(fā)育，籽粒中GmSPP1表達(dá)量一直在

6、升高。在12h光照/12h黑暗環(huán)境(LD)和持續(xù)光照(LL)環(huán)境下，GmSPP1與編碼大豆蔗糖磷酸合成酶基因GmSPS1的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。LD條件時(shí)，GmSPP1表達(dá)呈單峰態(tài)，先升高后降低，并且每24h為一個(gè)周期，GmSPP1表達(dá)變化與蔗糖含量變化趨勢(shì)一致。在LL條件下，GmSPP1表達(dá)量也呈單峰態(tài)，先升高后降低，并且每12h為一個(gè)周期，與蔗糖含量變化趨勢(shì)一致。轉(zhuǎn)GmSPP1基因的擬南芥株系種子中的蔗糖含量與野生型相比顯著升高，擬南芥