堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌PC465在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用技術(shù)及效果評價(jià).pdf

1、本論文研究了一株對蝦腸道共生菌——堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465(Bacillus firmus)在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用技術(shù),并對其在促進(jìn)對蝦生長、提高存活率、增強(qiáng)免疫能力等方面的作用效果進(jìn)行了評價(jià)。研究主要分為四部分:
　　第一部分:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化和規(guī)?；l(fā)酵。碳源、氮源、無機(jī)鹽等多個方面優(yōu)化了該菌株的培養(yǎng)基成分,確定了包含初始pH、溫度,以及接種量等的最適培養(yǎng)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)基:蛋白胨5g、酵母提取物

2、1g、FeSO40.05g、自來水1L;最佳培養(yǎng)條件:初始 pH=6、溫度=28~37℃,接種量=4％總發(fā)酵液體積。在確定培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,對 PC465進(jìn)行了規(guī)模發(fā)酵。利用最佳優(yōu)化培養(yǎng)基在最佳簡單化培養(yǎng)條件下利用5L和50L容量發(fā)酵罐進(jìn)行14小時(shí)的規(guī)?；l(fā)酵,發(fā)酵后的菌懸液用4℃,7,500×g進(jìn)行離心后得到菌泥,將一部分菌泥收集置于-80℃進(jìn)行存放,一部分進(jìn)行冷凍干燥制成干粉。收獲的菌泥可與飼料原料混合制成含有一定添加濃度的

3、含有PC465芽孢的顆粒免疫飼料,也可與魚油和褐藻酸鈉混合液混合后包裹在商品飼料表面制成免疫飼料。
　　第二部分:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465在凡納濱對蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用及效果評價(jià)。將第一部分得到的含有一定添加濃度的PC465的飼料應(yīng)用到3m3養(yǎng)殖水體(3m2×1m)的凡納濱對蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中,研究了添加濃度、投喂頻率等應(yīng)用技術(shù)參數(shù)對對蝦生長和成活率的影響,并分析了對蝦血淋巴中免疫相關(guān)酶ACP和SOD活性以及類淋巴組織中 STAT基因表達(dá)

4、情況,用于綜合評價(jià)PC465的作用效果。在整個試驗(yàn)中測量試驗(yàn)前后凡納濱對蝦的濕重,每個周進(jìn)行凡納濱對蝦的血淋巴的抽取并分別用于ACP和SOD酶活的測定,每個周進(jìn)行凡納濱對蝦類淋巴的摘取,并進(jìn)行 Total RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及相對real-time PCR的測定。結(jié)果表明,在35d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi),飼料中堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465添加量為106、108和1010CFU/g均能顯著提高凡納濱對蝦的生長率(P<0.05),1010CFU/g的添加

5、量組的對蝦在整個試驗(yàn)期的促生長效果和STAT基因表達(dá)量略高于106和108CFU/g添加量組;但綜合評估生長促進(jìn)效果和芽孢桿菌添加量,則106CFU/g添加量的比增效率達(dá)5.19×10-7CFU,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組;在飼料中用107CFU/g的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465添加量,在35d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi),采取間隔“1+1”、間隔“4+3”和連續(xù)不斷的方式投喂凡納濱對蝦,均能顯著提高對蝦的生長率和對蝦淋巴器官中 STAT基因的表達(dá)水平(P<0.05)

6、,且以連續(xù)投喂組的效果最好。
　　第三部分:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465在凡納濱對蝦工廠化養(yǎng)殖中的應(yīng)用及效果評價(jià)。將第一部分得到的含有一定添加濃度的PC465的飼料應(yīng)用到30m3養(yǎng)殖水體(30m2×1m)的凡納濱對蝦工廠化養(yǎng)殖生產(chǎn)中,期間定期采樣分析凡納濱對蝦生長率,存活率,腸道消化酶活性,腸道內(nèi)表面結(jié)構(gòu),用于評價(jià)PC465的作用效果。結(jié)果顯示:在30d的實(shí)驗(yàn)期間內(nèi),飼料中堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌PC465添加量為107和109CFU/g均能顯著

7、提高凡納濱對蝦的生長率和SGR以及存活率(P<0.05),添加飼料中堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465添加量為107和109CFU/g均能顯著提高凡納濱對蝦能夠顯著提高對蝦腸道的淀粉酶和蛋白酶活性(P<0.05);并且在連續(xù)投喂第15天能夠顯著促進(jìn)對蝦腸道脂肪酶的活性(P<0.05);添加添加飼料中堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465添加量為107和109CFU/g能夠顯著改變對蝦腸道內(nèi)表面的結(jié)構(gòu),并且109CFU/g的投喂?jié)舛蕊@著地改變期內(nèi)表面結(jié)構(gòu)。

8、>　　第四部分:堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 PC465添加到飼料中對凡納濱對蝦血淋巴免疫相關(guān)因子表達(dá)水平的影響。將PC465添加到飼料中投喂對蝦,在實(shí)驗(yàn)開始后的0h,6h,18h,48h和168h取樣,抽取血淋巴注入 RNAlater中4℃過夜后置于-80℃保存。提取血淋的Total RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR分析proPO,SP,Crustin,Penaeidin,lysozyme和Dicer-1的免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯