副豬嗜血桿菌的分離與單抗制備及其抗原表位鑒定.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS),屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬,可以引起豬的格拉瑟氏病。本病在豬群中可以引起豬的全身性疾病,如纖維素性多漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病。副豬嗜血桿菌在各豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮,并為世界范圍的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 本研究從黑龍江某爆發(fā)格拉瑟氏病的豬場分離得到一株副豬嗜血桿菌的菌株命名為HLJ-018,并將HLJ-018全菌懸液作為免疫原,免

2、疫BALB／c小鼠,采用細胞融合技術(shù),經(jīng)過Westernblot和間接ELISA方法篩選陽性克隆后,獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌HPS的單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞株2D2。單克隆抗體重鏈為IgG2a亞型,輕鏈為κ鏈。MAb2D2特異性良好,可與HLJ-018菌株和外膜蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。本實驗通過對小鼠進行體內(nèi)細菌清除試驗發(fā)現(xiàn),單克隆抗體2D2和多抗都具有細菌清除能力,單克隆抗體2D2的發(fā)揮效力時間稍遲于多抗對照組,但2D2的細菌清除能

3、力明顯高于空白和陰性對照兩個組,說明單克隆抗體2D2具有較好的細菌清除能力。
　　 為了鑒定MAb2D2對應(yīng)的抗原表位,本實驗利用制備的MAb2D2為靶分子對噬菌體線性12肽庫進行了生物篩洗,經(jīng)過3輪的篩選,獲得了針對靶分子的噬菌體克隆1000余倍的富集。從第3輪篩選的克隆中隨機挑選12個進行ELISA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這12個克隆均具有與該單抗結(jié)合的活性,經(jīng)過DNA測序分析發(fā)現(xiàn)這12個克隆具有相同的核心序列GAPMHMATL。通過BL

4、ASTp分析,這個核心序列與巴氏桿菌屬的放線桿菌的FeoB蛋白的572-579位氨基酸有88％的相似性,并且根據(jù)western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)該單抗所識別蛋白大小約為67Kd,也與FeoB蛋白大小相符。FeoB是Feo的組成之一。Feo蛋白是位于細胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運二價游離鐵離子的轉(zhuǎn)運蛋白。關(guān)于亞鐵離子的轉(zhuǎn)運蛋白Feo作為毒力蛋白的研究在單胞菌、細螺旋體、幽門螺桿菌、弗氏致賀菌、沙門氏菌、軍團桿菌和藍藻菌中均有報道。在本次試驗中我們獲得了