副豬嗜血桿菌的分離與單抗制備及其抗原表位鑒定.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS),屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬,可以引起豬的格拉瑟氏病。本病在豬群中可以引起豬的全身性疾病,如纖維素性多漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病。副豬嗜血桿菌在各豬場(chǎng)引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮,并為世界范圍的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究從黑龍江某爆發(fā)格拉瑟氏病的豬場(chǎng)分離得到一株副豬嗜血桿菌的菌株命名為HLJ-018,并將HLJ-018全菌懸液作為免疫原,免

2、疫BALB／c小鼠,采用細(xì)胞融合技術(shù),經(jīng)過(guò)Westernblot和間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆后,獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌HPS的單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞株2D2。單克隆抗體重鏈為IgG2a亞型,輕鏈為κ鏈。MAb2D2特異性良好,可與HLJ-018菌株和外膜蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)細(xì)菌清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),單克隆抗體2D2和多抗都具有細(xì)菌清除能力,單克隆抗體2D2的發(fā)揮效力時(shí)間稍遲于多抗對(duì)照組,但2D2的細(xì)菌清除能

3、力明顯高于空白和陰性對(duì)照兩個(gè)組,說(shuō)明單克隆抗體2D2具有較好的細(xì)菌清除能力。
　　 為了鑒定MAb2D2對(duì)應(yīng)的抗原表位,本實(shí)驗(yàn)利用制備的MAb2D2為靶分子對(duì)噬菌體線性12肽庫(kù)進(jìn)行了生物篩洗,經(jīng)過(guò)3輪的篩選,獲得了針對(duì)靶分子的噬菌體克隆1000余倍的富集。從第3輪篩選的克隆中隨機(jī)挑選12個(gè)進(jìn)行ELISA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這12個(gè)克隆均具有與該單抗結(jié)合的活性,經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這12個(gè)克隆具有相同的核心序列GAPMHMATL。通過(guò)BL

4、ASTp分析,這個(gè)核心序列與巴氏桿菌屬的放線桿菌的FeoB蛋白的572-579位氨基酸有88％的相似性,并且根據(jù)western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)該單抗所識(shí)別蛋白大小約為67Kd,也與FeoB蛋白大小相符。FeoB是Feo的組成之一。Feo蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)游離鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。關(guān)于亞鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Feo作為毒力蛋白的研究在單胞菌、細(xì)螺旋體、幽門(mén)螺桿菌、弗氏致賀菌、沙門(mén)氏菌、軍團(tuán)桿菌和藍(lán)藻菌中均有報(bào)道。在本次試驗(yàn)中我們獲得了