副豬嗜血桿菌耐藥性分子機制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩127頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌或條件致病菌,1910年K.Glasser首先發(fā)現(xiàn)并報道該病原,該菌感染豬后可引發(fā)多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來,由副豬嗜血桿菌所引起的革拉瑟氏病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一種重要細(xì)菌性疾病。發(fā)病后及時采用抗生素進行治療可顯著降低動物死亡率,同時在生產(chǎn)過程中適當(dāng)添加抗生素也可在一定程度上降低該病的發(fā)生率。但隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在養(yǎng)豬業(yè)中的

2、廣泛使用,細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出,與此同時也有研究資料表明亞抑制濃度的抗生素可以影響細(xì)菌的代謝過程而改變細(xì)菌的毒力或細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)能力等。
   本研究圍繞副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機理、耐藥質(zhì)粒的分布情況及其與亞抑制濃度氟苯尼考相互作用進行研究,以了解副豬嗜血桿菌耐藥情況、耐藥機理及亞抑制濃度氟苯尼考對其轉(zhuǎn)錄譜的影響,為合理使用抗菌藥物提供理論基礎(chǔ),主要研究內(nèi)容、方法及結(jié)果如下:
   1.副豬嗜血

3、桿菌耐喹諾酮類藥物的機制研究
   副豬嗜血桿菌血清型眾多,免疫預(yù)防往往因為疫苗交叉保護力低而致免疫失敗,抗生素治療便成為控制革拉瑟氏病的主要手段和措施。氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、殺菌力強等優(yōu)點而在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中得到廣泛應(yīng)用。研究表明細(xì)菌對喹諾酮類藥產(chǎn)生耐藥性主要通過編碼旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因gyrA和parC發(fā)生突變而引起,同時也存在由質(zhì)粒qnr及外排泵所介導(dǎo)的耐藥。目前國外已圍繞副豬嗜血桿菌的藥物敏感性及耐藥性等問題進

4、行了大量研究,但國內(nèi)的相關(guān)研究相對較少。
   本研究首先采用特異性16S rRNA PCR方法對臨床分離株進行鑒定,確認(rèn)分離株是副豬嗜血桿菌后測定菌株對萘啶酸、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的敏感性,然后用特異性PCR擴增副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和MIC值較高的臨床分離株的gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)并進行測序。采用Blast法對測序結(jié)果進行分析,包括副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型間的比對及耐藥株與敏感株之間的比對。在測MIC

5、的同時添加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺以檢測是否存在由外排泵介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性,同時還設(shè)計特異性引物以擴增質(zhì)粒qnr以檢測是否存在由質(zhì)粒所介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。
   研究結(jié)果表明,副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型的QRDR序列間具有高度的保守性,未發(fā)現(xiàn)有差異基因。而耐藥株的gyrA和parC的QRDR區(qū)域存在數(shù)量不等、位置各異的突變位點,其中GyrA以83位和87位的突變?yōu)橹?,發(fā)生突變的主要方式為s

6、er-83-phe和ser-83-tyr,asp-87-asn、asp-87-gly和asp-87-tyr。而ParC以73位和77位為主;GyrA的突變在副豬嗜血桿菌耐喹諾酮類藥物的機理中占主導(dǎo)作用,而ParC的突變僅起次要作用,往往發(fā)生于GyrA突變之后。在所用的臨床分離株中未發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒和外排泵所介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。研究結(jié)果可以為制定副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。
   2.副豬嗜血桿

7、菌耐藥質(zhì)粒的提取及功能分析
   常見的耐藥因子達(dá)數(shù)百種之多,其中部分耐藥因子可通過染色體突變產(chǎn)生并可以垂直傳播,部分耐藥因子由質(zhì)粒等可移動元件所介導(dǎo),能夠水平傳播。目前CLSI尚未確定各種抗菌藥物對副豬嗜血桿菌耐藥性的判定標(biāo)準(zhǔn),因此不能僅僅依據(jù)各種藥物對副豬嗜血桿菌的MIC值大小確定菌株是否耐藥,若直接用PCR等方法去檢測耐藥因子則效率較低。本研究通過從副豬嗜血桿菌臨床分離株提取耐藥質(zhì)粒,以了解副豬嗜血桿菌臨床分離株耐藥質(zhì)粒的

8、流行情況及可能的耐藥情況。
   本研究用Qiagen公司質(zhì)粒小提試劑盒對156株副豬嗜血桿菌臨床分離株進行質(zhì)粒提取,所獲得的質(zhì)粒先用合適的內(nèi)切酶進行酶切,再與相應(yīng)的載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑陽性重組子進行測序、注釋,進而獲得質(zhì)粒分離菌株的耐藥情況。
   本研究僅在1株臨床分離株(A67)中分離出質(zhì)粒,其大小約為4.2kb。內(nèi)切酶Sau3AI可以將所分離出的質(zhì)粒進行有效切割,獲得大小分別為2.7kb和1.5kb的片段

9、,將小片段與經(jīng)內(nèi)切酶BamHI進行酶切后的pUC19載體進行連接,連接產(chǎn)物成功轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性重組子送上海生工生物有限公司用M13正、反向引物對插入序列進行測序。再根據(jù)所測得的小片段的堿基序列設(shè)計引物,以所提質(zhì)粒為模板進行測序,直至測通。用DNAstar軟件對測序所獲得的序列進行拼接并刪除重復(fù)序列,得到一閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA,其大小為4248bp,其中主要包含有mobA、mobB和mobC等移動因子和sul2及strA兩

10、種耐藥因子,質(zhì)粒序列已保存至GenBank(No.FJ670543)。
   對含有耐藥質(zhì)粒的菌株進行了鏈霉素和磺胺甲基異惡唑的藥物敏感性試驗,其MIC值大小分別為128和512μg/mL。所提取的質(zhì)粒可以成功轉(zhuǎn)化至多殺性巴氏桿菌,轉(zhuǎn)化菌對上述兩種藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究結(jié)果表明,該質(zhì)??梢越閷?dǎo)副豬嗜血桿菌對鏈霉素和磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。
   3.亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄譜的影響研究
   不同濃度的

11、抗生素對細(xì)菌會產(chǎn)生不同的作用,高濃度抗生素對細(xì)菌產(chǎn)生抑制或殺滅作用,而低濃度抗生素不但不能抑制或殺滅細(xì)菌,而且有可能作為一種信號物質(zhì)對細(xì)菌的代謝過程進行調(diào)節(jié),進而影響細(xì)菌的毒力和適應(yīng)性等特性。
   本研究選用我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛使用的廣譜抗生素——氟苯尼考作為研究對象,探討亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄譜的影響。根據(jù)GenBank所公布的副豬嗜血桿菌SH0165株全序列(CP001321)設(shè)計探針,由Agilent公司進行

12、芯片的設(shè)計與制作。
   將副豬嗜血桿菌臨床分離株SH0165株分別于添加亞抑制濃度氟苯尼考(0.25μg/mL)和不添加藥物的條件下培養(yǎng)16h,分別提取mRNA用于后續(xù)的芯片研究,每個處理組設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。以mRNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA及cRNA,并對cRNA進行熒光標(biāo)記,點校進行檢測而獲得差異表達(dá)基因,用實時熒光定量PCR對差異表達(dá)基因進行驗證。
   經(jīng)亞抑制濃度氟苯尼考作用后,副豬嗜血桿菌的轉(zhuǎn)錄譜較對照組發(fā)生

13、較明顯的改變,共有163個基因表達(dá)水平變化在1.5倍(p<0.05)以上,其中96個基因表達(dá)上調(diào),另外67個基因表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因主要包括參與碳水化合物代謝、鐵離子攝取與利用、潛在毒力因子神經(jīng)氨酸酶等,這些基因的表達(dá)上調(diào)可以增強細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)能力,同時也可能改變菌株的潛在毒力。而作為主要抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素,亞抑制濃度氟苯尼考對蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因的抑制作用卻很輕微。
   本研究結(jié)果表明,臨床上使用低劑量抗生素預(yù)防呼

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論