副豬嗜血桿菌耐藥性分子機制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌或條件致病菌，1910年K.Glasser首先發(fā)現(xiàn)并報道該病原，該菌感染豬后可引發(fā)多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來，由副豬嗜血桿菌所引起的革拉瑟氏病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一種重要細(xì)菌性疾病。發(fā)病后及時采用抗生素進行治療可顯著降低動物死亡率，同時在生產(chǎn)過程中適當(dāng)添加抗生素也可在一定程度上降低該病的發(fā)生率。但隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在養(yǎng)豬業(yè)中的

2、廣泛使用，細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出，與此同時也有研究資料表明亞抑制濃度的抗生素可以影響細(xì)菌的代謝過程而改變細(xì)菌的毒力或細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)能力等。
　　 本研究圍繞副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機理、耐藥質(zhì)粒的分布情況及其與亞抑制濃度氟苯尼考相互作用進行研究，以了解副豬嗜血桿菌耐藥情況、耐藥機理及亞抑制濃度氟苯尼考對其轉(zhuǎn)錄譜的影響，為合理使用抗菌藥物提供理論基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容、方法及結(jié)果如下：
　　 1.副豬嗜血

3、桿菌耐喹諾酮類藥物的機制研究
　　 副豬嗜血桿菌血清型眾多，免疫預(yù)防往往因為疫苗交叉保護力低而致免疫失敗，抗生素治療便成為控制革拉瑟氏病的主要手段和措施。氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、殺菌力強等優(yōu)點而在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中得到廣泛應(yīng)用。研究表明細(xì)菌對喹諾酮類藥產(chǎn)生耐藥性主要通過編碼旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因gyrA和parC發(fā)生突變而引起，同時也存在由質(zhì)粒qnr及外排泵所介導(dǎo)的耐藥。目前國外已圍繞副豬嗜血桿菌的藥物敏感性及耐藥性等問題進

4、行了大量研究，但國內(nèi)的相關(guān)研究相對較少。
　　 本研究首先采用特異性16S rRNA PCR方法對臨床分離株進行鑒定，確認(rèn)分離株是副豬嗜血桿菌后測定菌株對萘啶酸、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的敏感性，然后用特異性PCR擴增副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和MIC值較高的臨床分離株的gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)并進行測序。采用Blast法對測序結(jié)果進行分析，包括副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型間的比對及耐藥株與敏感株之間的比對。在測MIC

5、的同時添加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺以檢測是否存在由外排泵介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性，同時還設(shè)計特異性引物以擴增質(zhì)粒qnr以檢測是否存在由質(zhì)粒所介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。
　　 研究結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清型的QRDR序列間具有高度的保守性，未發(fā)現(xiàn)有差異基因。而耐藥株的gyrA和parC的QRDR區(qū)域存在數(shù)量不等、位置各異的突變位點，其中GyrA以83位和87位的突變?yōu)橹?，發(fā)生突變的主要方式為s

6、er-83-phe和ser-83-tyr，asp-87-asn、asp-87-gly和asp-87-tyr。而ParC以73位和77位為主；GyrA的突變在副豬嗜血桿菌耐喹諾酮類藥物的機理中占主導(dǎo)作用，而ParC的突變僅起次要作用，往往發(fā)生于GyrA突變之后。在所用的臨床分離株中未發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒和外排泵所介導(dǎo)的細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。研究結(jié)果可以為制定副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。
　　 2.副豬嗜血桿

7、菌耐藥質(zhì)粒的提取及功能分析
　　 常見的耐藥因子達(dá)數(shù)百種之多，其中部分耐藥因子可通過染色體突變產(chǎn)生并可以垂直傳播，部分耐藥因子由質(zhì)粒等可移動元件所介導(dǎo)，能夠水平傳播。目前CLSI尚未確定各種抗菌藥物對副豬嗜血桿菌耐藥性的判定標(biāo)準(zhǔn)，因此不能僅僅依據(jù)各種藥物對副豬嗜血桿菌的MIC值大小確定菌株是否耐藥，若直接用PCR等方法去檢測耐藥因子則效率較低。本研究通過從副豬嗜血桿菌臨床分離株提取耐藥質(zhì)粒，以了解副豬嗜血桿菌臨床分離株耐藥質(zhì)粒的

8、流行情況及可能的耐藥情況。
　　 本研究用Qiagen公司質(zhì)粒小提試劑盒對156株副豬嗜血桿菌臨床分離株進行質(zhì)粒提取，所獲得的質(zhì)粒先用合適的內(nèi)切酶進行酶切，再與相應(yīng)的載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑陽性重組子進行測序、注釋，進而獲得質(zhì)粒分離菌株的耐藥情況。
　　 本研究僅在1株臨床分離株(A67)中分離出質(zhì)粒，其大小約為4.2kb。內(nèi)切酶Sau3AI可以將所分離出的質(zhì)粒進行有效切割，獲得大小分別為2.7kb和1.5kb的片段

9、，將小片段與經(jīng)內(nèi)切酶BamHI進行酶切后的pUC19載體進行連接，連接產(chǎn)物成功轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組子送上海生工生物有限公司用M13正、反向引物對插入序列進行測序。再根據(jù)所測得的小片段的堿基序列設(shè)計引物，以所提質(zhì)粒為模板進行測序，直至測通。用DNAstar軟件對測序所獲得的序列進行拼接并刪除重復(fù)序列，得到一閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，其大小為4248bp，其中主要包含有mobA、mobB和mobC等移動因子和sul2及strA兩

10、種耐藥因子，質(zhì)粒序列已保存至GenBank(No.FJ670543)。
　　 對含有耐藥質(zhì)粒的菌株進行了鏈霉素和磺胺甲基異惡唑的藥物敏感性試驗，其MIC值大小分別為128和512μg/mL。所提取的質(zhì)粒可以成功轉(zhuǎn)化至多殺性巴氏桿菌，轉(zhuǎn)化菌對上述兩種藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究結(jié)果表明，該質(zhì)?？梢越閷?dǎo)副豬嗜血桿菌對鏈霉素和磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。
　　 3.亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄譜的影響研究
　　 不同濃度的

11、抗生素對細(xì)菌會產(chǎn)生不同的作用，高濃度抗生素對細(xì)菌產(chǎn)生抑制或殺滅作用，而低濃度抗生素不但不能抑制或殺滅細(xì)菌，而且有可能作為一種信號物質(zhì)對細(xì)菌的代謝過程進行調(diào)節(jié)，進而影響細(xì)菌的毒力和適應(yīng)性等特性。
　　 本研究選用我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛使用的廣譜抗生素——氟苯尼考作為研究對象，探討亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄譜的影響。根據(jù)GenBank所公布的副豬嗜血桿菌SH0165株全序列(CP001321)設(shè)計探針，由Agilent公司進行

12、芯片的設(shè)計與制作。
　　 將副豬嗜血桿菌臨床分離株SH0165株分別于添加亞抑制濃度氟苯尼考(0.25μg/mL)和不添加藥物的條件下培養(yǎng)16h，分別提取mRNA用于后續(xù)的芯片研究，每個處理組設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。以mRNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA及cRNA，并對cRNA進行熒光標(biāo)記，點校進行檢測而獲得差異表達(dá)基因，用實時熒光定量PCR對差異表達(dá)基因進行驗證。
　　 經(jīng)亞抑制濃度氟苯尼考作用后，副豬嗜血桿菌的轉(zhuǎn)錄譜較對照組發(fā)生

13、較明顯的改變，共有163個基因表達(dá)水平變化在1.5倍(p＜0.05)以上，其中96個基因表達(dá)上調(diào)，另外67個基因表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因主要包括參與碳水化合物代謝、鐵離子攝取與利用、潛在毒力因子神經(jīng)氨酸酶等，這些基因的表達(dá)上調(diào)可以增強細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)能力，同時也可能改變菌株的潛在毒力。而作為主要抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素，亞抑制濃度氟苯尼考對蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因的抑制作用卻很輕微。
　　 本研究結(jié)果表明，臨床上使用低劑量抗生素預(yù)防呼