利用宿主介導(dǎo)RNAi進(jìn)行蚜蟲(chóng)防治的研究.pdf

1、利用宿主介導(dǎo)RNAi進(jìn)行蚜蟲(chóng)防治的研究重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文（學(xué)術(shù)學(xué)位）學(xué)生姓名：唐平華指導(dǎo)教師：胡宗利教授教授專業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二O一二年十二月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要I摘要蚜蟲(chóng)是一種同翅目農(nóng)林業(yè)主要害蟲(chóng)，繁殖力非常強(qiáng)，分布極廣，給農(nóng)作物和果樹(shù)等經(jīng)濟(jì)植物造成嚴(yán)重的直接危害，并且能夠傳播多種植物病毒。目前防治蚜蟲(chóng)仍然以化學(xué)農(nóng)藥為主，但是容易造成嚴(yán)重污染環(huán)境和農(nóng)副產(chǎn)品，使蚜蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性。隨著人類對(duì)環(huán)保意識(shí)和生

2、活品質(zhì)的提高，更為安全、持久、高效的防治蚜蟲(chóng)的方法得到越來(lái)越多的關(guān)注。PCOO2基因是豌豆蚜蟲(chóng)唾液腺分泌的一種非常重要的蛋白基因，在蚜蟲(chóng)取食寄主植物過(guò)程中是必需的，PCOO2蛋白的N段含有一段分泌信號(hào)，在其他物種中沒(méi)有任何同源蛋白。NavdeepS.Mutti等人在對(duì)豌豆蚜蟲(chóng)注射覆蓋PCOO2基因大部分開(kāi)放閱讀框的siRNA，PCOO2的轉(zhuǎn)錄水平在注射后第三天顯著下降，豌豆蚜蟲(chóng)在第三天死亡一半，PCOO2基因是豌豆蚜蟲(chóng)的必需基因。本研究

3、通過(guò)GenBank找到豌豆蚜蟲(chóng)的基因序列，采用同源克隆法克隆到與豌豆蚜蟲(chóng)PCOO2基因同源的桃蚜的基因片段525bp，命名為APCOO2，構(gòu)建沉默載體pBIN19：：APCOO2i，通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育能夠產(chǎn)生靶基因siRNA的轉(zhuǎn)基因番茄，利用轉(zhuǎn)基因番茄植株飼喂桃蚜，觀察蚜蟲(chóng)體內(nèi)靶基因的表達(dá)情況，試圖利用轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)RNAi，達(dá)到安全、持久、高效防治蚜蟲(chóng)的目的，在科學(xué)上具有很大的創(chuàng)新性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。主要研究

4、內(nèi)容及結(jié)果如下：①桃蚜APCOO2基因的克隆以桃蚜總RNA為模板，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到525bp大小的片段，將其命名為APCOO2，通過(guò)NCBIBLAST生物學(xué)信息分析，結(jié)果表明該片段的基因序列與豌豆蚜蟲(chóng)PCOO2有85%的相似度。②pBIN19：：APCOO2i沉默載體的構(gòu)建在桃蚜APCOO2基因片段兩端分別引入酶切加位點(diǎn)（HindIII&XbaI）（KpnI&XhoI），構(gòu)建中間載體pHANN

5、IBALAPCOO2，然后將包含35S啟動(dòng)子、APCOO2基因、35S終止子的DNA片段剪切連接到表達(dá)載體pBIN19中構(gòu)建成桃蚜APCOO2沉默載體。③轉(zhuǎn)基因番茄植株的培育以番茄AC＋＋子葉為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)侵染番茄子葉，將CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下的pBIN19：：APCOO2i表達(dá)載體轉(zhuǎn)入番茄，經(jīng)抗性培養(yǎng)基A3篩選誘導(dǎo)出愈傷組織，在誘芽培養(yǎng)基A4誘導(dǎo)出芽，經(jīng)過(guò)50mgLKan及250mgL的Carb篩選，獲得一