日本腦炎病毒NS2A蛋白拮抗宿主RNAi免疫的功能研究.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)的作用機制目前基本清楚，細(xì)胞內(nèi)的RNaseⅢ類的Dicer蛋白識別并切割dsRNA（double-stranded RNA），產(chǎn)生小分子干擾siRNA RNA(small interfering RNA)等非編碼小分子RNA，Argonaute(AGO)蛋白隨即結(jié)合這些小分子RNA，將其裝配為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RIS

2、C)，RISC特異性降解與小分子RNA序列匹配的靶RNA，或抑制靶RNA的翻譯途徑，最終達(dá)到沉默靶基因的目的。
　　目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)，在植物、昆蟲等低等生物中，RNAi作為一種重要的抗病毒免疫機制發(fā)揮關(guān)鍵作用。針對于宿主這種特異的免疫方式，一些植物和昆蟲病毒進(jìn)化獲得了拮抗宿主RNAi免疫的功能元件VSR(viral suppressor ofRNA silencing)，能夠有效抑制基于RNAi的抗病毒免疫(RNA-based

3、 virusimmunity，RVI)，實現(xiàn)病毒滋生的感染和傳播。哺乳動物可通過干擾素等天然免疫系統(tǒng)對抗病毒感染，盡管已有研究發(fā)現(xiàn)RNAi通路的存在，但哺乳動物細(xì)胞能否利用RNAi對抗病毒感染尚缺乏足夠證據(jù)。
　　日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種以庫蚊為傳播媒介的蟲媒病毒。臨床上可以引起嚴(yán)重的腦炎癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對人類健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。其基因組

4、是長約為10976bp的單股正鏈RNA，包含兩端的非編碼區(qū)和一個單一的開放讀碼框，分別編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白。作為蟲媒病毒，其天然宿主既包括昆蟲也包括哺乳動物，是研究RNAi免疫通路的理想材料。日本腦炎病毒在哺乳動物宿主中拮抗經(jīng)典的干擾素免疫通路研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，而其在昆蟲或者哺乳動物中拮抗RNAi免疫的研究還處于起步階段。發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)病毒的VSR對深入認(rèn)識病毒感染的分子機制具有重要意義，也可進(jìn)一步以此為工具證明哺乳動物體

5、內(nèi)存在RNAi抗病毒免疫機制。
　　本研究首先通過真核表達(dá)和體外生化等手段對日本腦炎病毒的全部蛋白拮抗RNAi的功能進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)NS2A具有拮抗RNAi的功能;進(jìn)一步通過生物信息學(xué)和反向遺傳學(xué)技術(shù)，分析了NS2A蛋白上可能與RNA具有相互作用的位點，并構(gòu)建了相應(yīng)的突變病毒，對其生物學(xué)特征進(jìn)行了初步評價。
　　本研究的內(nèi)容包括如下兩個部分:
　　一、日本腦炎病毒VSR的篩選與功能研究
　　目前，已知的VSR

6、基本為病毒自身編碼的蛋白，如弗洛克豪斯病毒(Flockhouse virus，F(xiàn)HV)的B2蛋白。在蚊蟲細(xì)胞中，外源加入EGFP的dsRNA/siRNAs可導(dǎo)致EGFP的mRNA降解，而FB2可以保護EGFP的基因組不受到RNAi作用的影響。本部分研究首先在上述系統(tǒng)中共轉(zhuǎn)染重組表達(dá)的日本腦炎病毒的10個蛋白，確定了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與FB2具有相類似的功能，可以保護EGFP的mRNA不受到細(xì)胞內(nèi)RNAi通路的降解。隨后，敲除該系

7、統(tǒng)中RNAi通路中的關(guān)鍵作用蛋白，以Northern blot的方法進(jìn)一步證明了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與dsRNA/siRNAs相互作用來發(fā)揮VSR的功能，并以此確定了NS2A蛋白是日本腦炎病毒的VSR。由于NS2A蛋白可能與dsRNA/siRNAs結(jié)合，而RNA為帶負(fù)電分子，因此推測NS2A蛋白上的正電荷氨基酸可能起到了關(guān)鍵性的作用。隨后，通過生物信息學(xué)的方法比對不同的黃病毒NS2A蛋白序列，發(fā)現(xiàn)其中的大部分正電荷氨基酸都非常保守

8、，并且在一定區(qū)域存在多個正電荷氨基酸聚集的現(xiàn)象，這些正電荷氨基酸很有可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究通過I-TASSER蛋白預(yù)測網(wǎng)站的數(shù)據(jù)分析，推測出NS2A蛋白的可能折疊方式，并利用PyMOL軟件進(jìn)行蛋白表面位點分析，發(fā)現(xiàn)正電荷氨基酸位點基本在蛋白跨膜區(qū)以外的折疊連接處。因此，推測K26、T33、K84、R98、R140、R163、R171、K193、K226這9個氨基酸可能是影響NS2A蛋白發(fā)揮VSR作用的關(guān)鍵位點。
　　二、日本

9、腦炎病毒VSR缺陷型病毒的構(gòu)建與生物學(xué)特征分析
　　根據(jù)上述的實驗結(jié)果，采用反向遺傳學(xué)的技術(shù)手段，在日本腦炎病毒感染性克隆E70的基礎(chǔ)上，通過融合PCR的方法進(jìn)行NS2A蛋白的單點突變，成功構(gòu)建了出T33I、K84A、R98A、R140A、R163A、R171A、K193A、K226A8個帶有點突變的感染性克隆質(zhì)粒。進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染等實驗操作后，在BHK-21細(xì)胞系上成功拯救出了T33I、K84A、R98A、R140A、R163

10、A5種點突變病毒，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR實驗、病毒蝕斑實驗、間接免疫熒光實驗、確定突變病毒在細(xì)胞上具有感染性，并成功引入突變位點，進(jìn)一步觀察到T33I、K84A、R163A突變病毒形成的蝕斑直徑明顯小于野生型病毒E70。隨后，在C6/36、Aag2、293T細(xì)胞系上分別接種E70與突變病毒，通過病毒在細(xì)胞上的復(fù)制能力顯示病毒的基本生物學(xué)特性。實驗結(jié)果表明:R98A、R140A、R163A突變病毒在不同細(xì)胞系上的生長復(fù)制能力與E70基本一致;

11、K84A在3種細(xì)胞系上的復(fù)制能力都明顯減弱，說明K84A位點可能影響了病毒基因組的基本復(fù)制與病毒蛋白的包裝;T33I位點在信號通路缺陷的C6/36細(xì)胞上復(fù)制與E70基本一致，而在RNAi通路完整的Aag2與293T細(xì)胞中復(fù)制能力都明顯減弱，說明T33I位點可能影響了病毒VSR的功能。在動物實驗中，本研究分別測定了突變病毒在乳鼠、成鼠上的神經(jīng)毒力與神經(jīng)侵襲力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T33I、K84A、R98A位點的突變病毒與E70相比，在神經(jīng)毒力方面明