布魯氏菌介導的宿主小泛素化及抗凋亡機制的研究.pdf

1、類泛素化修飾主要是參與細胞周期調控、信號傳導、轉錄調控、細胞凋亡、細胞增殖與分化、蛋白轉運、DNA修復以及應激反應等多種細胞功能調控。目前,有關類泛素對細菌介導的細胞生物進程變化研究較少。布魯氏菌是一種典型的兼性胞內菌,寄生在宿主巨噬細胞內復制繁殖,對宿主細胞功能有很大的影響。因此,研究布魯氏菌介導對細胞內類泛素的變化與布魯氏菌引起凋亡的影響具有重要意義。本研究主要包括以下幾方面:
　　1.鼠源類泛素蛋白SUMO1/2/3的原核表

2、達、純化及抗體的制備
　　經鑒定、測序成功構建原核表達載體pET-SUMO1/2/3。將其在大腸桿菌中表達,可見相對分子質量約為30KD的蛋白帶,而且在6h時表達量最高。用蛋白純化系統(tǒng)純化類泛素融合蛋白,免疫兔子,制備多克隆抗體血清經Western-blot分析表明表達的蛋白具良好的反應原性。
　　2.布魯氏菌介導對細胞類泛素表達影響的研究
　　布魯氏菌M5-90和16M菌株分別侵染巨噬細胞后,通過免疫印跡方法和熒光實

3、時定量方法分別檢測細胞中類泛素SUMO1蛋白表達水平與SUMO1/2/3 mRNA轉錄水平。結果顯示:布魯氏菌M5-90和16M菌株侵染巨噬細胞后,SUMO1蛋白水平與mRNA轉錄水平在12h內都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,M5-90侵染組SUMO1表達量在4h時最高(p<0.01),而16M侵染組在8h時表達量最高(p<0.01);在布魯氏菌侵染巨噬細胞時細胞中SUMO2 mRNA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,M5-90侵染組SUMO2

4、mRNA水平在4h和8h要明顯高于對照組與16M侵染組(p<0.01);SUMO3 mRNA水平在16M侵染時要顯著高于對照組和M5-90組,M5-90組8h時高于對照組(p<0.05),而在12h時低于對照組。
　　3.類泛素SUMO1真核表達載體的構建及對布魯氏菌胞內生存與細胞凋亡的影響
　　成功構建真核表達載體pcDNA-SUMO1。通過熒光實時定量方法測定pcDNA-SUMO1質粒在巨噬細胞中最佳轉染條件;通過瞬時轉

5、染重組質粒pcDNA-SUMO1使SUMO1在細胞中過量表達,用布魯氏菌侵染巨噬細胞后,用LgCFU方法檢測SUMO1對布魯氏菌胞內存活和細胞凋亡的影響,結果顯示:轉染pcDNA-SUMO1質粒組的胞內M5-90菌數(shù)量在12h內呈現(xiàn)下降趨勢,4h后轉染pcDNA-SUMO1質粒的胞內菌數(shù)顯著低于對照組(p<0.05),轉染pcDNA-SUMO1質粒的胞內16M菌數(shù)量在4h后呈現(xiàn)上升趨勢,顯著低于對照組(p<0.05);SUMO1在細胞中

6、過量表達,用布魯氏菌侵染巨噬細胞,用流式細胞術檢測SUMO1對布魯氏菌介導的凋亡的影響,結果顯示:布魯氏菌侵染巨噬細胞后,各組細胞凋亡率都呈現(xiàn)上升趨勢,轉染pcDNA空質粒組與對照組差異不顯著,轉染pcDNA-SUMO1質粒組的細胞凋亡率明顯高于對照組(p<0.05)。
　　以上研究結果表明:制備兔抗SUMO1/2/3蛋白多克隆抗體具有良好的反應原性;布魯氏菌在侵染細胞時能夠引起SUMO1蛋白表達與SUMO1/2/3mRNA轉錄水