擬南芥IKU2互作蛋白鑒定及同源四倍體分析.pdf

1、種子是植物最重要的生殖器官，對植物的生長繁衍至關(guān)重要。作為營養(yǎng)物質(zhì)的儲藏器官，種子也是大多數(shù)作物的最終收獲目標(biāo)，為人類的日常生活和生產(chǎn)提供食物、飼料、以及原材料，在人類的生存和發(fā)展中有著不可替代的作用。近年來通過突變體分析和高通量表達譜分析等方法已經(jīng)克隆了許多與種子形成和發(fā)育相關(guān)的基因，但對于這些基因之間的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)還有待深入研究。多倍體在高等植物中普遍存在，許多重要農(nóng)作物都是多倍體。多倍體在促進營養(yǎng)體、種子和果實產(chǎn)量方面有重要作用，其研

2、究一直受到研究者的高度重視。但目前關(guān)于同源多倍體表型、基因表達以及生理變化的機制還沒有深入的研究。本研究分為兩個主要部分，第一部分工作是利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定控制種子大小的HAIKU2(IKU2)的互作蛋白，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析IKU2等基因的功能，第二部分工作是對新獲得的一個同源四倍體擬南芥進行分析，為同源四倍體表型變化的可能機制提供了新信息，主要結(jié)果如下：
　　 1、采用SMART擴增技術(shù)構(gòu)建了一個高質(zhì)量的擬南芥0-3 d角

3、果cDNA文庫。IKU2被預(yù)測為富畬亮氨酸的受體激酶(LRR-RLK)，以IKU2蛋白的胞外域篩到一個候選蛋白AJH1；以胞內(nèi)域為誘餌篩到27個候選基因。通過濾紙印跡染色(X-Gal)、重新Mating雜交和共轉(zhuǎn)化等方法，驗證了挑選的候選基因與對應(yīng)的誘餌蛋白互作的真實性，但是它們都不能與IKU2全長蛋白發(fā)生相互作用。
　　 2、從ABRC購買了19個基因的29個突變體，共篩選得到13個基因的18個陽性純合體，但這些材料的種子大小

4、均與野生型沒有顯著的差別。構(gòu)建IKU2-OE、IKU2反義、IKU2-GFP、IKU2BN-GFP(胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)、IKU2BW-GFP(胞外結(jié)構(gòu)域)以及ORG4-OE、ORG4反義、YFP-ORG4、ORG4-GFP、ORG4-RNAi等載體，并都轉(zhuǎn)化了擬南芥。通過半定量PCR分析挑選的轉(zhuǎn)基因材料都獲得了相應(yīng)的目的單株；但檢測各融合蛋白的熒光信號，只有IKU2BN-GFP被檢測到。
　　 3、對各載體轉(zhuǎn)基因家系的粒重分析沒有得到

5、穩(wěn)定一致的變異，但從IKU2反義轉(zhuǎn)化材料中發(fā)現(xiàn)一個植株，其植株和種子均增大。我們將此株系命名為Big seedling(Bs)，后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)BS為一個同源四倍體材料。
　　 4、同源四倍體擬南芥(BS)能夠產(chǎn)生與二倍體(WT)顯著不同的表現(xiàn)型，主要體現(xiàn)在葉片、主莖、花、角果和種子等器官增大，生長發(fā)育延緩等。通過掃描電鏡觀察成熟種子，以及通過微分干涉顯微鏡觀察萌發(fā)后4-11 d的子葉，發(fā)現(xiàn)BS子葉增大主要是由于細(xì)胞體積增大而不是細(xì)

6、胞數(shù)目增多造成的。
　　 5、BS的胚發(fā)育比WT慢約1d，但相同發(fā)育階段BS的胚均比WT大；BS每一粒種子中可溶性蛋白質(zhì)、脂肪酸、可溶性糖以及淀粉的含量分別比WT多約64%，45%，57%和55%；但各物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有發(fā)生變化。對8個粒重相關(guān)基因和34個細(xì)胞周期基因進行表達分析發(fā)現(xiàn)，ICK1、ICK2和ICK5在BS蓮座葉和花器官中穩(wěn)定地上調(diào)表達1.5-2倍，而其它基因的表達變化在BS和WT中差異不顯著。
　　 6、應(yīng)

7、用植物激素、葡萄糖、甘露醇和NaCl等多種物質(zhì)處理BS和WT幼苗，發(fā)現(xiàn)BS對單一的植物激素處理與WT沒有差異，而對葡萄糖處理比WT顯著敏感。通過甘露醇和NaCl對照實驗發(fā)現(xiàn)BS對葡萄糖敏感不是由于滲透脅迫造成的，因為BS比WT更加耐受NaCl脅迫，對甘露醇處理與WT沒有差別。通過與另一個同源四倍體4COL對照發(fā)現(xiàn)四倍體對葡萄糖敏感具有普遍性。
　　 7、對葡萄糖處理下BS，4COL和WT第3片真葉以及根表皮細(xì)胞大小和數(shù)目進行考察

8、發(fā)現(xiàn)，與對照培養(yǎng)基相比，葡萄糖處理下四倍體的細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目受到顯著的抑制，而二倍體受到的影響較小。
　　 8、通過流式細(xì)胞檢測葡萄糖和甘露醇處理10 d后BS、4COL以及WT幼苗真葉的倍性水平(細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制)的變化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖處理后細(xì)胞倍性降低而甘露醇處理后細(xì)胞倍性升高，這種變化趨勢在四倍體和二倍體中是相同的。
　　 9、對葡萄糖處理后四倍體和二倍體的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)與對照培養(yǎng)基相比，CYCD、CYCB以及I