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文檔簡介
1、中國荷斯坦牛最適宜的環(huán)境溫度為5~20℃。由于我國夏季高溫可達35℃以上,且持續(xù)時間較長,中國荷斯坦牛在夏季經(jīng)歷的強烈持久的熱應(yīng)激會引發(fā)的機體熱損傷,甚至多器官功能障礙綜合征,嚴重影響其生產(chǎn)和繁殖性能,并使其免疫力大大降低,因此熱應(yīng)激已經(jīng)成為限制奶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。
趨化因子配體3(Chemokine ligand3,CCL3)是臼趨化因子亞家族(CC趨化因子亞家族)中重要成員之一,在紅系祖細胞、巨核細胞集落的形成和炎
2、癥細胞的趨化募集過程中發(fā)揮重要作用;與多發(fā)性骨髓瘤、人類免疫缺陷病毒感染、急性冠脈綜合征、哮喘等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。CCL3基因的發(fā)現(xiàn)為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供新靶點,也為動物的抗逆育種提供了新思路。
目前還未有關(guān)于CCL3在熱應(yīng)激過程中的生物學(xué)功能的相關(guān)報道,但本課題組前期研究顯示,中國荷斯坦牛外周全血經(jīng)42℃熱激1h和4h后,CCL3表達出現(xiàn)明顯上調(diào)。因此我們將其作為與奶牛耐熱性相關(guān)的候選功能基因篩查該基因內(nèi)的SNP
3、s,以期為動物的抗逆育種提供新思路。本試驗首先克隆了奶牛CCL3基因的DNA序列,并在群體范圍內(nèi)進行了聚合酶鏈式反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)分析,以全面篩查CCL3基因內(nèi)的SNPs。通過進行CCL3基因SNPs與其血常規(guī)、血清生化指標等的關(guān)聯(lián)分析,對其SNPs進行分子解析、精細評價.
4、 1.熱應(yīng)激對中國荷斯坦牛直腸溫度、血常規(guī)、血清生化指標的影響
非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛直腸溫度極顯著低于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01)。非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛外周血的淋巴細胞數(shù)量、單核細胞數(shù)量、單核細胞百分含量、淋巴細胞百分比極顯著高于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01);非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛外周血的白細胞計數(shù)
5、、中性粒細胞數(shù)量、嗜酸性細胞數(shù)量、嗜堿性細胞數(shù)量、中性粒細胞百分比、嗜酸細胞百分含量、嗜堿細胞百分含量、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、紅細胞體積分布寬度均極顯著低于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01),其中熱應(yīng)激臨界期(26℃)平均血紅蛋白含量顯著低于熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.05),熱應(yīng)激臨界期(26℃)平均血紅蛋白濃度極顯著低于熱應(yīng)激期(37℃)(P<0
6、.01)。非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛外周血血清中丙二醛極顯著低于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01),且熱應(yīng)激臨界期(26℃)丙二醛也極顯著低于熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01)。非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛外周血血清中堿性磷酸酶極顯著高于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01)。熱應(yīng)激期(37℃)中國荷斯坦牛外周血血清中堿性磷酸酶雖較熱應(yīng)激臨界期(26℃
7、)有所降低,但二者間差異不顯著(P>0.05)。非熱應(yīng)激期(15℃)中國荷斯坦牛外周血總抗氧化能力極顯著高于熱應(yīng)激臨界期(26℃)(P<0.01)和非熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.01),且熱應(yīng)激臨界期(26℃)中國荷斯坦牛外周血血清總抗氧化能力顯著高于熱應(yīng)激期(37℃)(P<0.05)。
2.中國荷斯坦牛CCL3基因DNA序列的克隆及其生物信息學(xué)分析
本試驗根據(jù)實驗室克隆的CCL3基因的cDNA序列,設(shè)計了1
8、對用于奶牛CCL3基因克隆的引物,最終獲得全度為1874 bp的奶牛CCL3基因序列,該序列包括3個外顯子(1~89 bp、945~1061 bp和1364~1874 bp)和2個內(nèi)含子(90~944bp和1062~1363bp),其基因結(jié)構(gòu)與其他哺乳動物CCL3基因結(jié)構(gòu)一致。此外,CCL3基因的多物種比對結(jié)果顯示,中國荷斯坦牛CCL3基因DNA序列與歐洲牛的同源性最高,為92.77%,與人和黑猩猩的分別為53.66%和53.52%。<
9、br> 3.中國荷斯坦牛CCL3基因PCR-SSCP檢測及其多態(tài)性分析
試驗采用PCR-SSCP的方法對所克隆的中國和斯坦牛CCL3基因的序列進行了SNPs檢測。試驗設(shè)計的6對引物,其中P2和P6引物對檢測到多態(tài),測序結(jié)果顯示在512(C→T)、560(C→A)、562(C→T)、1512(T→C)和1793(A→G)這5個位點發(fā)生了突變。
使用Haploview4.0軟件對CCL3基因進行了連鎖不平衡
10、分析;通過對D'值95%可信區(qū)間上下限的分析,在CCL3基因范圍內(nèi)構(gòu)建了2個單倍域(Haplotypeblock),分別為512位、560位和562位SNP所代表的序列形成單倍域1,與1512位和1793位的SNP所代表的序列形成單倍域2。根據(jù)單倍域內(nèi)SNPs之間的r2值挑選了2個htSNPs(512 C→T和1512 T→C)。其中htSNP512屬于低度多態(tài)(PIC<0.25),htSNP1512屬于中度多態(tài)性(0.25<PIC<0
11、.5)。x2適合性檢驗結(jié)果表明,CCL3基因的兩個htSNPs均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)。
4.中國荷斯坦牛CCL3基因多態(tài)性與直腸溫度、血常規(guī)等的關(guān)聯(lián)分析
htSNP512可顯著影響中國荷斯坦牛熱應(yīng)激期的直腸溫度和平均紅細胞體積(P<0.05),且CT個體的直腸溫度顯著高于CC個體(P<0.05),而CT個體的平均紅細胞體積顯著低于CC個體(P<0.05)。htSNP15
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