甜菜抗叢根病胞內(nèi)鈣信號特征的研究.pdf

1、甜菜是世界上重要的糖料作物，是除熱帶甘蔗以外的一個主要食糖來源。在甜菜生產(chǎn)過程中受到諸多病害的危害，其中甜菜叢根病是最為嚴(yán)重的病害之一。甜菜叢根病是近年來在世界各地普遍發(fā)生的一種甜菜病毒病害，該病對甜菜生產(chǎn)危害極大，發(fā)生后塊根減產(chǎn)40％～60%，含糖下降4～9度，嚴(yán)重地塊甚至絕產(chǎn)，已成為制約甜菜生產(chǎn)及制糖工業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。提高甜菜抗叢根病性已成為甜菜生產(chǎn)需迫切解決的問題。因此，深入研究甜菜抗叢根病生理機(jī)制，對加速甜菜抗病育種、擴(kuò)大

2、甜菜種植面積、提高農(nóng)民收益具有重大意義。本論文采用鈣離子熒光探針、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)及同位素標(biāo)記技術(shù)，以侵染叢根病病源甜菜葉片為研究材料，通過研究病源侵染后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中第二信使—胞內(nèi)鈣離子濃度與分布及依賴于鈣離子的蛋白激酶活性變化，揭示胞內(nèi)鈣離子及蛋白激酶在甜菜抗叢根病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用，為豐富和完善甜菜抗叢根病細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。研究主要取得如下結(jié)果：
　　1．建立了檢測甜菜細(xì)胞內(nèi)鈣離子的技術(shù)體系。應(yīng)用

3、鈣離子熒光探針結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，以甜菜葉片為材料，低溫4℃下裝載鈣離子熒光探針Fluo-3/AM（20μmol·L-1）120min，將材料置于室溫25℃放置120min，將鈣離子探針Fluo-3/AM置入甜菜葉片細(xì)胞內(nèi)，且在實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)有熒光猝滅現(xiàn)象。為研究甜菜壞死黃脈病毒侵入甜菜葉片細(xì)胞后胞內(nèi)Ca2+變化提供技術(shù)支撐。
　　2.甜菜壞死黃脈病毒浸染甜菜葉片后，抗叢根病品種胞質(zhì)Ca2+濃度發(fā)生相應(yīng)的變化，并得到胞質(zhì)C

4、a2+快速增高的特征曲線，而感病品種胞質(zhì)Ca2+濃度基本未發(fā)生變化。病毒侵染甜菜葉片引起的胞內(nèi)Ca2+水平增高主要來源于細(xì)胞間隙的鈣離子。表明Ca2+作為甜菜-叢根病病原物互作過程中的第二信使是激活甜菜抗叢根病所必經(jīng)途徑。
　　3.茉莉酸、水楊酸作為信號分子在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中占據(jù)重要的位置，外源JA、SA處理可以誘導(dǎo)甜菜葉細(xì)胞游離鈣離子濃度升高，與甜菜壞死黃脈病毒侵染甜菜葉片細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子的變化相一致，初步表明JA、SA是病

5、毒侵染甜菜后胞內(nèi)鈣信號的上游信號分子。
　　4.從外源底物、ATP濃度、反應(yīng)時間、金屬離子濃度等方面篩選測定甜菜葉片細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶活性的最佳條件，建立了體外檢測甜菜葉片胞內(nèi)蛋白激酶活性的體系：外源底物為Histon-Ⅲ，其濃度為0.5mg/mL，ATP濃度為50μmol/L，Mg2+濃度為5mmol/L，啟動反應(yīng)10min。通過在體系中不加Ca2+、加Ca2+、加Ca2+和CaM、加Ca2+和TFP進(jìn)行蛋白激酶活性對比試驗(yàn)，初步鑒