粘球菌DK1622胞內(nèi)游離鈣離子濃度的測(cè)定及鈣結(jié)合蛋白基因的預(yù)測(cè).pdf

1、鈣離子(Ca2+)是重要的信使分子，參與了真核生物的許多細(xì)胞行為過程，如DNA合成的起始、有絲分裂、細(xì)胞分裂等。細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)受到鈣離子通道(Ca2+ channels)、鈣泵(Ca2+ pumps)、鈣結(jié)合蛋白(Ca2+-bindingproteins，CaBPs)的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，使得靜息狀態(tài)下，[Ca2+]i維持在很低水平（10-7M），遠(yuǎn)低于胞外液體中Ca2+濃度（10-3M）。細(xì)胞利用形成的Ca2+濃度梯度

2、來傳遞信息，將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞受到刺激后，受到嚴(yán)格調(diào)控的[Ca2+]i發(fā)生瞬間變化，引起磷酸化反應(yīng)、調(diào)節(jié)蛋白激活、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等一系列反應(yīng)。
　　 目前對(duì)Ca2+在細(xì)菌細(xì)胞活動(dòng)中的作用還不甚清楚，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中[Ca2+]i嚴(yán)格控制在和真核生物相似的水平（100～300 nM），細(xì)菌細(xì)胞也有離子通道、初級(jí)和次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鈣結(jié)合蛋白，這些都可能參與了Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)，有證據(jù)表明，[Ca2+]i的變化與細(xì)

3、菌的許多細(xì)胞行為，如枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的孢子形成、大腸桿菌（Escherichia coli）的趨化性、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)的異形胞分化、粘細(xì)菌(myxobacteria)的子實(shí)體發(fā)育等有關(guān)，越來越多的證據(jù)表明Ca2+在細(xì)菌中起到調(diào)節(jié)劑的作用。
　　 測(cè)定細(xì)胞中[Ca2+]i對(duì)于研究Ca2+作為胞內(nèi)信使的作用是必需的。Ca2+起到信使作用的觀點(diǎn)是基于對(duì)環(huán)境信號(hào)會(huì)誘發(fā)[Ca2+]i變化

4、的認(rèn)識(shí)，因此，確定細(xì)胞受刺激后胞質(zhì)Ca2+水平，對(duì)于研究Ca2+在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用是至關(guān)重要的。由于細(xì)菌獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征（細(xì)胞小，胞外有細(xì)胞壁）、試劑的毒性及活細(xì)菌操作的困難，測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞[Ca2+]i是一個(gè)挑戰(zhàn)。雖然如此，鈣結(jié)合染料fura-2和光蛋白aequorin、obelin已經(jīng)在原核生物中成功使用。其中，obelin是一種非常好的Ca2+指示劑，對(duì)Ca2+濃度變化反應(yīng)迅速，且與鎂離子(Mg2)的結(jié)合力較aequorin更低。

5、通過分子DNA技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞中組成性表達(dá)obelin基因，可以在不同種的細(xì)菌中連續(xù)監(jiān)測(cè)胞質(zhì)自由Ca2+濃度的變化。
　　 粘細(xì)菌是一類革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，作為一種高等的原核生物，具有特殊的多細(xì)胞行為，主要表現(xiàn)為滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力、分化發(fā)育過程和社會(huì)性的細(xì)胞行為三個(gè)方面，是研究原核生物分化發(fā)育和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的重要模式材料。已有的研究表明，在粘細(xì)菌的細(xì)胞行為過程中，鈣及鈣信號(hào)(calcium signals)扮演了十分重要的角色，但目前

6、仍沒有粘細(xì)菌[Ca2+]i測(cè)定的報(bào)道。雖然S蛋白在粘球菌分化發(fā)育末期的粘孢子生成階段起到鈣調(diào)蛋白類似組分的功能，但還不清楚粘細(xì)菌中還存在其它哪些CaBPs組分。
　　 本論文通過在黃色粘球菌DK1622中表達(dá)obelin基因來測(cè)定[Ca2+]i。首先利用表達(dá)載體pET15b、pET22b在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)obelin基因，其中利用pET22b有正確表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察菌體，紫外激發(fā)，可以觀察到黃綠色熒光。然后利

7、用粘球菌自主復(fù)制質(zhì)粒pZJY41和整合質(zhì)粒pSWU30在DK1622中表達(dá)obelin基因，RT--PCR結(jié)果顯示，obelin可以在DK1622中表達(dá)，但熒光顯微鏡下觀察不到菌體熒光。
　　 本論文根據(jù)原核生物中已公布的5個(gè)CaBPs序列及EF-hand鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列的保守性，通過序列比對(duì)及保守序列搜索的方法，在DK1622預(yù)測(cè)的7514個(gè)ORF中分析出5個(gè)可能編碼CaBPs的基因--MXAN0106、MXAN09