豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及ELISA法在抗原定量測(cè)定中的應(yīng)用.pdf

1、以豬瘟病毒中國(guó)兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)為實(shí)驗(yàn)材料，首先采用常規(guī)細(xì)胞實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)的方法，得到正常犢牛睪丸細(xì)胞增殖曲線(xiàn)和帶毒睪丸細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒不僅不影響犢牛睪丸細(xì)胞的生長(zhǎng)，反而促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖，培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)，帶毒的牛睪丸細(xì)胞計(jì)數(shù)是未帶毒細(xì)胞的117.5％。初步確立了該毒株在原代犢牛睪丸細(xì)胞中增殖的規(guī)律與基本特性。再進(jìn)一步運(yùn)用直接免疫熒光法確定出最佳細(xì)胞初始密度、最佳接毒量及接毒方式的產(chǎn)毒模型，建立了常規(guī)的病毒增殖曲

2、線(xiàn)。
　　 以建立的細(xì)胞及病毒生長(zhǎng)曲線(xiàn)及產(chǎn)毒模型為依據(jù)，根據(jù)GMP生產(chǎn)車(chē)間的實(shí)際情況，從生產(chǎn)種毒繁殖、原代細(xì)胞制備、CSFV的感染、CSFV感染后維持液的調(diào)節(jié)以及帶CSFV的犢牛睪丸細(xì)胞的多次傳代這幾個(gè)對(duì)CSFV增殖有影響的因素方面入手進(jìn)一步展開(kāi)工作。
　　 嚴(yán)格控制生產(chǎn)種毒，優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)的生產(chǎn)種毒，是疫苗病毒含量達(dá)標(biāo)的必要保障。
　　 原代細(xì)胞制備過(guò)程中，依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：《規(guī)程》）

3、無(wú)菌摘取犢牛睪丸，在《規(guī)程》的指導(dǎo)基礎(chǔ)上，調(diào)整消化時(shí)間、溫度可以同時(shí)達(dá)到提高細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量的雙重效果。將《規(guī)程》消化時(shí)間調(diào)整為0.25％的胰酶37℃ 消化30 min后降低溫度繼續(xù)消化。結(jié)果，每1g睪丸組織可制備3×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液400-500ml，是傳統(tǒng)消化法的兩倍，并且細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，消化后期降低溫度可減輕后期胰酶的作用強(qiáng)度，減少對(duì)已消化好細(xì)胞的傷害。
　　 脾組織毒對(duì)次代牛睪丸細(xì)胞有很強(qiáng)的刺激作用，生產(chǎn)接毒時(shí)適度

4、減少組織毒，同時(shí)補(bǔ)入一定量病毒含量≥106細(xì)胞毒液，可減少組織毒對(duì)細(xì)胞的刺激作用，降低細(xì)胞的脫瓶率，提高病毒液的收次。
　　 在病毒液收獲期間，增大維持液量，將《規(guī)程》中10％的維持液調(diào)節(jié)為20％,4天收獲一次延長(zhǎng)為8天收獲一次，經(jīng)兔體檢驗(yàn)，病毒含量仍能達(dá)到5×104ml。
　　 病毒含量測(cè)定方面，應(yīng)用豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒（IDEXXHerdCheck Co.）對(duì)經(jīng)兔體檢驗(yàn)已知滴度的20份HCLV半成品細(xì)胞病毒