結(jié)核分枝桿菌抗原定量檢測(cè)技術(shù)的建立及其初步評(píng)價(jià).pdf

1、結(jié)核病(TB)仍然是威脅全球人類健康一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。在2012年估計(jì)有新增結(jié)核病例860萬(wàn)，死于結(jié)核病有130萬(wàn)人，其中有30萬(wàn)人為HIV陽(yáng)性。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)的結(jié)核病發(fā)病率和與人類免疫缺陷病毒(HIV)共感染的病例數(shù)在未來(lái)數(shù)十年內(nèi)將大幅增加。在世界低收入國(guó)家的負(fù)擔(dān)較重，特別是在東南亞和撒哈拉以南的非洲。
　　在這些高負(fù)擔(dān)的地區(qū)，結(jié)核病診斷的基石仍然是痰涂片鏡檢。在HIV陰性的患者中，常規(guī)臨床檢測(cè)敏感性的變化在35％和80％之間

2、，但在艾滋病毒感染的患者中，敏感性低至20％。此外，在后一組中，痰稀缺性是常見的，這就需要增加操作過(guò)程，如誘導(dǎo)痰或支氣管鏡進(jìn)行樣品采集。傳統(tǒng)的痰涂片檢查在兒童和肺外結(jié)核的患者中的用處也有限。分枝桿菌培養(yǎng)需要幾個(gè)星期才能提供結(jié)果，價(jià)格昂貴且需要專門的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施，在大多數(shù)高負(fù)擔(dān)地區(qū)仍無(wú)法使用。當(dāng)前，較新的T細(xì)胞定量檢測(cè)[γ-干擾素的釋放試驗(yàn)(IGRAs)]在高負(fù)擔(dān)的地區(qū)沒有實(shí)用性，同時(shí)不能區(qū)分潛伏的活動(dòng)性結(jié)核病。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAATs)有

3、限的特異性，使之在結(jié)核高負(fù)擔(dān)地區(qū)無(wú)法廣泛使用。結(jié)核病診斷仍然需要價(jià)格低廉，快速，易于推廣的檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品。
　　迄今為止，大多數(shù)已開發(fā)的方法是基于特定循環(huán)抗體的檢測(cè)。在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，肺結(jié)核的血清學(xué)診斷一直處于研究階段，但現(xiàn)在仍然沒有一個(gè)具有廣泛臨床應(yīng)用價(jià)值的檢測(cè)方法?？乖瓩z測(cè)幾乎可以肯定證實(shí)活動(dòng)性結(jié)核的存在。相比之下，抗體檢測(cè)并不能確定活動(dòng)性結(jié)核，甚至在清除感染半年后也能檢測(cè)到抗體反應(yīng)。我們應(yīng)該集中更多的力量在直接檢測(cè)體液中抗原

4、的基礎(chǔ)上來(lái)開發(fā)檢測(cè)方法。這樣的檢測(cè)方法對(duì)患者的診斷及治療過(guò)程中的隨訪可能是有用的。因?yàn)樵诩膊』钴S的階段，結(jié)核病具有高度的傳染性，對(duì)這種疾病快速，特異的檢測(cè)，不僅可以遏制結(jié)核病的蔓延，同時(shí)將幫助醫(yī)生開展恰當(dāng)、及時(shí)的治療，又可以減少多重耐藥(MDR)以及普遍耐藥(XDR)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)化的機(jī)會(huì)。
　　1983年，在腦脊液中第一次檢測(cè)到結(jié)核抗原，自此以后陸續(xù)有學(xué)者在痰液和腦脊液中通過(guò)ELISA、乳膠凝集法檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌抗原。近期

5、文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)則以ELISA和膠體金等檢測(cè)血清、CSF和尿中的PPD衍生物及其特定的菌體成份，如38kD抗原、MPT64、LAM等，其敏感性和特異性分別在20％～94.0％和78.6％～100％。但這些抗原都比較單一，而且大多數(shù)商業(yè)抗原檢測(cè)試劑盒不能滿足臨床的需要，因此這些結(jié)核分枝桿菌抗原的檢測(cè)方法未能廣泛應(yīng)用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病。
　　本研究構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pBVIL1-38KD、pBVIL1-ESAT6、pBVIL1-CFP10，經(jīng)

6、溫度誘導(dǎo)在大腸桿菌中高效表達(dá)，用離子交換層析方法純化蛋白;融合蛋白IL1-38KD+ESAT6+ CFP10、GST-38KD+ESAT6+ CFP10經(jīng)溫度、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用離子交換層析、親和層析方法純化蛋白。將純化得到的蛋白免疫動(dòng)物，獲得了高效價(jià)的單克隆及多克隆抗體。選用ProteinG親和層析法純化抗體，同時(shí)以純化得到的抗體分別作為包被抗體和檢測(cè)抗體建立雙抗體夾心檢測(cè)抗原ELISA法，在此基礎(chǔ)上建立了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌

7、抗原的定量檢測(cè)技術(shù)，并進(jìn)行初步臨床評(píng)價(jià)。
　　本研究共分五部分進(jìn)行:
　　1、以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出結(jié)核分枝桿菌38KD，ESAT6，CFP10基因。通過(guò)分子克隆方法，成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌38KD、ESAT6、CFP10基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pBVIL1-38KD，pBVIL1-ESAT6，pBVIL1-CFP10。通過(guò)42℃水浴誘導(dǎo)質(zhì)粒pBVIL1-38KD，pBVIL1-ESAT6，pB

8、VIL1-CFP10在原核表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)出約53 kDa的IL1-38KD、21.3 kDa的IL1-ESAT6、21.1 kDa的IL1-CFPI0重組蛋白。通過(guò)離子交換層析法對(duì)IL1-38KD， IL1-ESAT6， IL1-CFP10重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)間接EILSA法對(duì)純化的蛋白進(jìn)行了活性的初步鑒定，結(jié)果顯示克隆表達(dá)的蛋白具有很好的靈敏度和特異性。
　　2、本研究是基于實(shí)驗(yàn)室成功地構(gòu)建了pBVIL1-38KD+ESAT

9、6+ CFP10、PGEX-38KD+ESAT6+ CFP10質(zhì)粒的基礎(chǔ)上。誘導(dǎo)表達(dá)后采用離子交換層析及親和層析對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，獲得了高濃度、高純度的融合蛋白。對(duì)蛋白的活性進(jìn)行了鑒定，與各分片段蛋白相比，提高了檢測(cè)敏感性，并具有很好的特異性。
　　3、將純化的蛋白免疫大耳白兔，得到了兔抗結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(38 KD、ESAT6、CFP10和融合抗原38KD+ESAT6+ CFP10)的多克隆抗體，效價(jià)分別為1∶32000

10、，1∶16000，1∶32000，1∶128000。將純化的蛋白免疫BALB/c小鼠，得到了鼠抗結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的單克隆抗體，抗38kD的陽(yáng)性克隆共4株:BBA171、BFE624、BBG411、BEA831，抗體滴度效價(jià)分別為1∶256000、1∶128000、1∶256000、1∶128000;抗ESAT6的陽(yáng)性克隆1株:BFF1024，抗體滴度效價(jià)為1∶512000;抗CFP10的陽(yáng)性克隆1株:BBG1028，抗體滴度效價(jià)為

11、1∶256000。
　　4、以單克隆、多克隆抗體為包被和標(biāo)記抗體，創(chuàng)建雙抗體夾心結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA檢測(cè)法。對(duì)試劑各反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件:包被抗體與酶標(biāo)抗體分別為兔抗38KD+ESAT6+ CFP10多抗與HRP-兔抗38KD+ESAT6+ CFP10多抗;包被抗體濃度為0.25ug/ml;樣品與稀釋液按50ul+50ul稀釋;酶標(biāo)抗體濃度為1∶600。同時(shí)建立了抗原ELISA法的

12、標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0218x+0.1387，R2=0.9933)，確定了最低檢測(cè)限(1.11 ng/ml)。在結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA方法的基礎(chǔ)上，建立了結(jié)核分枝桿菌抗原化學(xué)發(fā)光定量的檢測(cè)方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=15583x+89992，R2=0.9962)，確定了最低檢測(cè)限(0.46 ng/ml)。
　　5、對(duì)建立的結(jié)核抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行初步臨床評(píng)價(jià)，對(duì)接受抗結(jié)核治療的患者在不同時(shí)間段血清中抗原濃度的檢測(cè)，結(jié)果顯示患者血

13、清中的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原會(huì)隨著治療時(shí)間而逐漸降低。經(jīng)過(guò)對(duì)結(jié)核患者痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清中結(jié)核特異性抗原的檢測(cè)結(jié)果，抗原化學(xué)發(fā)光技術(shù)與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的符合率較高為92％，同時(shí)在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性的上清中，抗原的檢出率能達(dá)到27.11％。定量分析后結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的這段時(shí)間內(nèi)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原38KD、ESAT6、CFP10的分泌量主要集中在0.75ng/ml～40ng/ml之間。結(jié)核分枝桿菌特異性抗原化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)與商業(yè)