赤點石斑魚重組激活基因1與相關(guān)免疫因子的克隆分析及其發(fā)育早期免疫機(jī)制的研究.pdf

1、赤點石斑魚(Epinephelus akaara)經(jīng)濟(jì)價值高,是一種重要的海水養(yǎng)殖魚類。目前,赤點石斑魚仔稚魚期死亡率高,而且受到神經(jīng)壞死病毒的感染嚴(yán)重,人工增養(yǎng)殖一直受到制約;另一方面,赤點石斑魚基礎(chǔ)免疫學(xué)理論尚屬空白。為了闡明赤點石斑魚免疫系統(tǒng)隨個體發(fā)育變化的特點,本研究運用分子生物學(xué)技術(shù),從特異免疫和非特異免疫系統(tǒng)兩個層面出發(fā),對幾個主要的免疫學(xué)相關(guān)因子進(jìn)行深入研究和探討,并初步闡明了赤點石斑魚免疫系統(tǒng)早期發(fā)育的特點。主要研究成果

2、如下:
　　 1.克隆獲得了赤點石斑魚重組激活基因RAG1的cDNA序列。運用RACEPCR和嵌套PCR技術(shù),獲得了RAGl基因cDNA的5'端和3'端序列,經(jīng)ContigExpress軟件拼接,獲得赤點石斑魚RAGl基因的cDNA序列,其開放閱讀框為2778 bp的序列,3'非編碼區(qū)包含多腺苷酸加尾信號序列(AATAA),位于poly(A)上游的2867-2871位置。該cDNA序列編碼925個氨基酸,推導(dǎo)蛋白的預(yù)測分子量約為

3、105kDa(Genbak登錄號:HQ007253)。序列比對的結(jié)果顯示赤點石斑魚RAGl氨基酸序列結(jié)構(gòu)特點與高等哺乳動物相似,也是由非核心區(qū)和核心區(qū)組成,并且發(fā)現(xiàn)核心區(qū)相對較保守,在魚類中相似性高達(dá)90％以上。非核心區(qū)含有一個鋅指二聚體結(jié)構(gòu)域ZDD(氨基酸序列為142-270);核心區(qū)包括中心區(qū)和C端區(qū),中心區(qū)包含九聚體結(jié)合域NBD(217-364)和鋅指結(jié)構(gòu)域ZFB。本研究首次在魚類中構(gòu)建了ZDD和NBR的三維結(jié)構(gòu)模型,對深入研究魚

4、類免疫機(jī)制具有重要意義。
　　 2.揭示了RAG1基因在幼魚和成魚各組織中的表達(dá)特性。本研究首次克隆獲得了赤點石斑魚β-actin的ORF,并以此為內(nèi)部參照物,建立了熒光定量PCR方法。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAG1基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在胸腺和頭腎組織中,并且胸腺中的RAG1mRNA水平明顯高于頭腎組織。與4月齡幼魚相比,18個月齡赤點石斑魚腎臟和胸腺中的RAG1 mRNA水平顯著降低。免疫印跡和免疫組織化學(xué)法的實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了RAG1在

5、蛋白水平上的表達(dá)。
　　 3.克隆獲得了分泌型免疫球蛋白IgM重鏈基因的cDNA序列,并揭示了IgM基因mRNA在赤點石斑魚各組織分布特點。通過RACE PCR獲得了IgM重鏈cDNA全長(Genebank登錄號:HQ007252),包括2259個堿基,5'端非編碼區(qū)371 bp,開放閱讀框1737 bp,3'端非編碼區(qū)15l bp。3'端包括一個加尾信號(AATAA)和一個多聚A尾巴結(jié)構(gòu)。根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列由57

6、8個氨基酸殘基構(gòu)成,Genebank序列號為AEK82140,預(yù)測分子量為65 kDa。序列比對顯示,該IgM序列與其他已報道的IgM序列具有高度同源性,包括一個信號肽(L)、可變區(qū)(VH)、4個固定區(qū)(CH)和一個鉸鏈區(qū)(Hinge),初步推測該IgM屬于分泌型,并成功構(gòu)建了赤點石斑魚lgM重鏈的三維結(jié)構(gòu)。熒光實時定量PCR法對IgM的相對定量結(jié)果顯示,除了性腺之外,在腦、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、鰓、肌肉、胸腺、腸道中均檢測到了IgM

7、重鏈mRNA的表達(dá)。與4月齡相比,18個月齡魚的肝臟、腎臟、脾臟、心臟、鰓、胸腺中IgM重鏈mRNA顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.001),在腦和腸道中顯著下調(diào)表達(dá)(P＜0.001),肌肉中無顯著變化。
　　 4.克隆獲得了抗病毒蛋白Mx基因,并揭示了Mx基因mRNA在赤點石斑魚各組織的分布特點。Mx基因的cDNA序列全長為2200 bp,包括一個開放閱讀框1848 bp,5'端非編碼區(qū)68 bp和3'端非編碼區(qū)352 bp。其中3'端

8、非編碼區(qū)含有一個AATAA加尾信號和一個多聚A尾巴結(jié)構(gòu)。根據(jù)ORF框推導(dǎo)的氨基酸序列包括616個氨基酸殘基,分子質(zhì)量約69.76 kDa,理論等電點為5.32。序列比對發(fā)現(xiàn),該氨基酸序列在石首魚中同源性高達(dá)80％以上,屬于動力蛋白家族成員之一,具有保守的GTP酶結(jié)構(gòu)特征。利用熒光實時定量PCR法對4月齡和18月齡赤點石斑魚各組織中的Mx轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究顯示,除了性腺之外,腦、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、鰓、肌肉、胸腺、腸道中均檢測到了Mx

9、mRNA的存在,其中鰓組織中Mx的表達(dá)量最高。與4月齡幼魚相比,Mx在18月齡魚的腦、頭腎、和心臟中顯著下調(diào)表達(dá)(P＜0.05),但在脾臟中顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.001),肌肉、腸道、胸腺、肝臟和鰓中無顯著變化。
　　 5.克隆獲得了抗菌肽hepcidin基因的cDNA序列,并揭示了hepeidin基因mRNA在赤點石斑魚各組織中的分布特點。根據(jù)一對特異引物經(jīng)PCR擴(kuò)增在赤點石斑魚中獲得了一種抗菌肽eDNA序列,全長330 bp

10、,(GenBank登錄號:JN596423)。該序列包括一個長為258 bp的開放閱讀框,編碼86個氨基酸殘基。該氨基酸序列包含一個信號肽,信號肽與成熟肽之間的分割點位于Ala24和Leu25之間,相對分子質(zhì)量約為6.95 kDa,等電點為4.70。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),赤點石斑魚hepcidin屬于4個半胱氨酸的類型。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示,除了脾臟、腦和肌肉組織之外,肝臟、腎臟、心臟、鰓、胸腺、腸道中均檢測到了熒光信號,其中肝

11、臟組織中hepcidin的表達(dá)量最高。與4月齡幼魚相比,18月齡魚肝臟中hepcidin mRNA水平顯著上調(diào)表達(dá)(P＜0.001),而其他組織中則無顯著變化。
　　 6.通過RAG1基因和IgM基因早期表達(dá)規(guī)律,初步闡明了赤點石斑魚特異免疫系統(tǒng)的發(fā)育特點,并根據(jù)Mx基因和Hecidin基因的轉(zhuǎn)錄水平分析了仔稚魚期非特異免疫因子的作用。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示,RAG1基因在孵化后第15天有了明顯的轉(zhuǎn)錄,在37天時有顯著表達(dá)(

12、P＜0.05),在80天時轉(zhuǎn)錄量最高,是37天的10倍以上。IgM基因則在23天開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄,在29天有了顯著表達(dá)(P＜0.05),30天之后的轉(zhuǎn)錄量均超過29天的百倍以上,實驗結(jié)果說明由RAGl標(biāo)記的免疫器官在15天左右的稚魚期開始出現(xiàn),由IgM標(biāo)記的B細(xì)胞在23天左右的稚魚期開始具有功能。Mx mRNA在第2天時就被檢測到,到15天時有了一定的升高,在23天和29天時有了顯著的上調(diào)。受精卵即有抗菌肽的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并且在23天之前一直持

13、續(xù)在一個比較穩(wěn)定的水平,在29天時有顯著的高表達(dá),該結(jié)果顯示非特異免疫因子在發(fā)育早期就開始發(fā)揮作用。
　　 7.對中樞免疫器官胸腺的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了顯微觀察和描述,初步發(fā)現(xiàn)赤點石斑魚胸腺退化的現(xiàn)象。整個胸腺位于咽鰓骨上方、上耳咽匙肌內(nèi)側(cè)和前耳骨之間的鰓蓋骨背關(guān)節(jié)的背腹側(cè)角落里。4月齡魚胸腺外形長橢圓形,呈乳白色半透明,表面光滑,質(zhì)地松軟,實質(zhì)為致密結(jié)締組織,外被蓋一層結(jié)締組織被膜與咽腔及水環(huán)境相隔;18月齡赤點石斑魚胸腺組織明顯退化

14、,顏色與周圍的上皮組織難以區(qū)分,嚴(yán)重纖維化。光鏡切片觀察顯示,4月齡赤點石斑魚胸腺明顯分為內(nèi)皮質(zhì)區(qū)(髓質(zhì))、中皮質(zhì)區(qū)和外皮質(zhì)區(qū)(皮質(zhì)),且外皮質(zhì)區(qū)染色較深,內(nèi)皮質(zhì)區(qū)染色較淺。在胸腺內(nèi)還有許多明顯的結(jié)締小梁。外皮質(zhì)區(qū),由黏液細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、網(wǎng)狀上皮細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞組成最外層為一層扁平的上皮細(xì)胞;中皮質(zhì)區(qū),是由致密的淋巴細(xì)胞構(gòu)成,也有一些微管分布;內(nèi)皮質(zhì)區(qū),相當(dāng)于哺乳動物的胸腺髓質(zhì)區(qū),內(nèi)區(qū)淋巴細(xì)胞的數(shù)量較中區(qū)的少得多,而淺染的網(wǎng)狀上皮

15、細(xì)胞、成纖維細(xì)胞則明顯增多,同時微血管也很豐富,并且有胸腺小體出現(xiàn)。掃描電鏡顯示,4月齡魚胸腺中主要是胸腺細(xì)胞,而18月齡魚胸腺中的胸腺細(xì)胞明顯減少,并有大量纖維狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn),彼此連接成網(wǎng)狀。根據(jù)該結(jié)果初步推斷赤點石斑魚胸腺在成魚中存在退化現(xiàn)象。
　　 8.建立了熒光實時定量PCR檢測神經(jīng)壞死病毒(NNV)的方法,并對福建省東山縣和六鰲鎮(zhèn)的養(yǎng)殖赤點石斑魚進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,NNV主要集中在腦組織中,在其他組織中并沒檢測到。東山樣