茶兒茶素生物合成相關(guān)基因表達(dá)的實時熒光定量PCR分析.pdf

1、茶兒茶素生物合成主要涉及的酶類有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、LAR、ANS和ANR等，其中與非酯型兒茶素C、GC、EC和EGC合成直接相關(guān)的酶是LAR和ANR。尋找兒茶素生物合成的關(guān)鍵基因，對開展茶樹次生代謝基因工程研究具有重要意義。
　　 本論文首先對四個常用內(nèi)參基因在茶樹不同器官組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，篩選適合實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)的內(nèi)參基因；以茶樹鮮葉

2、為材料，利用qRT-PCR技術(shù)，研究了兒茶素生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)差異；利用高效液相色譜(HPLC)方法和酶學(xué)檢測方法，研究了兒茶素含量的變化和DFR/LAR、ANR酶活性變化；探討了兒茶素合成途徑中兒茶素含量變化與相關(guān)基因表達(dá)、酶活性變化之間的相關(guān)性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．檢測了18SrRNA、GAPDH、β-Actin和α-Tubulin四個常用內(nèi)參基因在茶樹不同器官組織中的表達(dá)情況，GeNorm和No

3、rmFinder軟件分析結(jié)果顯示，在qRT-PCR分析中，當(dāng)比較茶樹不同器官組織的基因表達(dá)差異時，可選擇β-Actin作為校正內(nèi)參基因；比較不同成熟度葉片和愈傷組織時，可以選擇GAPDH作為校正內(nèi)參基因。
　　 2．應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)，研究了兒茶素合成相關(guān)基因在茶樹鮮葉不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PAL、F3H、LAR和DFR的表達(dá)量隨葉片成熟度增加而逐漸下降；F3'HC4H在第一葉中表達(dá)豐富，隨著葉片成熟度增加而表

4、達(dá)量逐漸降低；CHI和F3’5'H的表達(dá)量從第一葉到第四葉沒有明顯的變化；ANR和ANS表達(dá)趨勢基本一致，在芽和第三葉中有較高表達(dá)；CHS和CsMYB2從第一葉到第三葉表達(dá)量比在芽和老葉中表達(dá)豐富；UFGT和CCoAOMT在第四葉中表達(dá)量最強(qiáng)。
　　 3．HPLC檢測結(jié)果顯示，不同發(fā)育階段茶鮮葉中，第一葉的兒茶素總量最高，芽次之，成熟葉片中明顯低于第一葉。從兒茶素各組分看，C、GC和EC含量較低且變化不明顯；而EGC的含量隨葉片