擬除蟲菊酯類農藥降解基因estA的表達、純化及活性分析.pdf

1、近年來，隨著擬除蟲菊酯類農藥的廣泛使用，由菊酯類農藥殘留產生的環(huán)境、食品污染和農產品國際貿易問題越來越嚴重，菊酯類農藥的生物降解逐漸成為研究的熱點。本論文以課題組已克隆的擬除蟲菊酯類農藥降解基因estA(genbank：DQ906143)為出發(fā)基因，進行了基因產物二級、高級結構的生物信息學分析；全長基因序列和具反應活性結構域基因序列的原核表達；表達產物的電泳檢測、復性及復性條件；表達產物的反應條件、環(huán)境穩(wěn)定性及對農藥的降解等方面的研究，

2、為進一步利用降解酶基因資源研制擬除蟲菊酯類農藥降解酶制劑，解決農產品農藥殘留提供技術平臺。
　　 EstA的生物信息學研究表明：EstA的分子量和等電點的理論值分別約為64.6KDa和4.40；EstA的二級結構為23.50％的α螺旋、25.12％的β折疊、7.13％的β轉角和44.25％的無規(guī)卷曲。α螺旋存在明顯的結構域差異性，其中80.6％的α螺旋存在于在第一個結構域(1-370aa)中；EstA無二硫鍵和信號肽；EstA具

3、有兩個結構域，第一個結構域包含前370個氨基酸，與酶催化活性相關，第二結構域包括剩余247個氨基酸(371-617)；EstA的催化位點為Ser207，Asp255和His313；EstA中存在鈣結合位點，分別為Lys278、Asp283、Asp337、Ala281。
　　 EstA全長編碼基因和催化活性結構域編碼基因的原核表達研究表明：全長編碼基因的表達產物具酯酶活性，而單一催化活性結構域編碼基因的表達產物無酯酶活性，證明Es

4、tA的第二個結構域雖然不具有催化位點，但可能與酶活性構象的形成密切相關；原核表達的EstA主要以包涵體形式存在，包涵體可經(jīng)6 mol/L的尿素有效溶解；EstA分解α醋酸萘酚實驗證明該酶具有羧酸酯酶活性，以羧酸酯酶活性為檢測指標的實驗表明：EstA表達產物的最佳復性條件為：pH7.5、Ca2+濃度2mmol/L、蛋白濃度20μg/mL。
　　 對EstA活性表達產物的理化性質研究表明：該酶的最適反應條件(α醋酸萘酚為底物)為：p

5、H7.0、Ca2+濃度0.1mmol/L、溫度35℃。氣相色譜檢測活性EstA對部分農藥的降解結果表明：該蛋白對擬除蟲菊酯類農藥高效氯氰菊酯、氯菊酯、氯烯炔菊酯、功夫菊酯及有機磷類農藥毒死蜱有降解能力，30℃條件下溫育八小時對上述農藥的降解率分別為：高效氯氰菊酯：79.07％、功夫菊酯：24.29％、氯烯炔菊酯：19.73％、氯菊酯：44.74％、毒死蜱：27.42％。
　　 極端環(huán)境實驗表明：EstA表達產物具高溫、強酸、強堿