對蝦淋巴組織的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)及其永生性轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、隨著對蝦人工養(yǎng)殖集約化的發(fā)展，對蝦病毒病日益頻繁爆發(fā)，對蝦細(xì)胞系是分離和純化對蝦病毒、研究病毒的致病機(jī)理、發(fā)展有效的診斷試劑和防控技術(shù)以及生產(chǎn)高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。盡管國內(nèi)外專家學(xué)者在對蝦細(xì)胞的體外培養(yǎng)和建系上進(jìn)行了大量的探索和不懈的努力，但目前對蝦的細(xì)胞培養(yǎng)仍然處于原代培養(yǎng)水平，永生性的細(xì)胞系一直未成功建立。因此，改進(jìn)現(xiàn)有對蝦原代培養(yǎng)技術(shù)，建立成熟高效的對蝦原代培養(yǎng)技術(shù)，從而能夠穩(wěn)定獲得大量原代培養(yǎng)的對蝦細(xì)胞單層，以及

2、探索和建立有效的對蝦細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，對于對蝦細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化研究，以及最終成功建立對蝦永生性細(xì)胞系都是至關(guān)重要的。
　　本文首先在分析總結(jié)前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了3種分別以0.2×L-15(I)、2×L-15(II)和1.5×L-15(III)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的新的對蝦培養(yǎng)基，以刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）的淋巴器官（又叫Oka器官）為材料，通過比較和驗(yàn)證以上3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，并結(jié)合對蝦淋巴

3、器官無菌制備技術(shù)，建立了成熟的對蝦淋巴器官原代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。結(jié)果表明，通過觀察對蝦細(xì)胞從組織塊遷出的起始時(shí)間、細(xì)胞單層達(dá)到70％~80%的匯合度所需時(shí)間、細(xì)胞壽命和生長狀態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)，在3種對蝦培養(yǎng)基中，以1.5×L-15為基礎(chǔ)并添加15%FBS、10%蝦肌提取液、5g·L-1NaCl、2g·L-1葡萄糖、20ng·mL-1生長因子、10μg·mL-1氨基酸、100IU·mL-1雙抗等配制的對蝦培養(yǎng)基III，滲透壓為621±20mOsm

4、·kg-1，pH為7.3~7.5，培養(yǎng)刀額新對蝦的淋巴組織細(xì)胞時(shí)效果最好。細(xì)胞從組織塊中遷出的時(shí)間最早（可在組織塊接種后2~3小時(shí)開始遷出）；細(xì)胞遷出最快，細(xì)胞單層達(dá)到70%~80%的匯合度所需時(shí)間最短（約為組織塊接種后16~24小時(shí)）；細(xì)胞貼壁緊，狀態(tài)好，壽命長（28(±3)天）。我們還發(fā)現(xiàn)，采用對蝦培養(yǎng)基III可支持對蝦淋巴組織塊重復(fù)貼壁后細(xì)胞的遷出和存活，提高了對蝦淋巴組織塊的利用率，從而可以更快地獲得較多的對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞。

5、r>　　同時(shí)，本文還檢測了在對蝦培養(yǎng)基III中生長的對蝦原代培養(yǎng)淋巴細(xì)胞對對蝦白斑病毒（WSSV）的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4×107、4×106和4×105個(gè)/μL滴度的WSSV病毒液接種對蝦淋巴細(xì)胞2天后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE），5天后，大多數(shù)WSSV感染細(xì)胞開始變圓、懸浮或死亡。而接種4×104個(gè)/μL滴度以及更低滴度的WSSV病毒液、滅活WSSV病毒液和PBS溶液的對蝦細(xì)胞都沒有出現(xiàn)明顯的

6、CPE。以上結(jié)果說明，采用對蝦培養(yǎng)基III培養(yǎng)的對蝦原代培養(yǎng)淋巴細(xì)胞對WSSV具有敏感性，可用于該病毒的相關(guān)研究。
　　其次，為找到對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞單層的有效傳代方法，本文設(shè)計(jì)并比較了13種傳代方法的傳代培養(yǎng)效果，其中包括基于8種消化液的9種消化方法：胰蛋白酶、膠原酶 II、中性蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、HyQTase、ECDS(Enzyme-free Cell Dissociation Solutio

7、n)和HyQTase/ECDS混合酶消化法，2種物理方法：冷PBS（4℃）處理和細(xì)胞刮刮洗，以及消化液和物理方法相結(jié)合的2種傳代方法:HyQTase和ECDS分別與4℃PBS處理相結(jié)合。通過比較消化時(shí)細(xì)胞的脫壁率、消化時(shí)間、傳代后細(xì)胞的形態(tài)和再貼壁率等，我們發(fā)現(xiàn)非哺乳動(dòng)物來源的消化酶HyQTase和非酶細(xì)胞消化液ECDS表現(xiàn)出較好的消化效果。HyQTase原液作用于細(xì)胞單層6分鐘可以將80%~89%的細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，細(xì)胞的再貼壁

8、率可達(dá)49.5±1.5%，但是稀釋后的HyQTase（50%and25%原液）作用8~10 mins仍表現(xiàn)為較低的細(xì)胞脫壁率（60%~69%）和再貼壁率（31.7±3.8%和25.6±4.0%）。ECDS消化液得到了相似的消化效果。ECDS原液消化時(shí)的細(xì)胞脫壁率和再貼壁率（80%~89%；50.3±2.7%）明顯高于其兩種稀釋液（50%和25%）消化時(shí)細(xì)胞的脫壁率（60%~69%）和再貼壁率（35..5±5.0%和28.0±1.5%）。

9、盡管4℃ PBS單獨(dú)使用時(shí)其消化效果并不明顯，但是當(dāng)其與HyQTase和ECDS原液溶液結(jié)合使用時(shí)，HyQTase和ECDS消化效果得到顯著的提高，消化時(shí)間也都由原來的6分鐘縮短為4.5分鐘，細(xì)胞的脫壁率達(dá)到90%~100%，細(xì)胞的再貼壁率也明顯提高，HyQTase為54.1±2.0%，ECDS為60.2±4.9%。我們還發(fā)現(xiàn)，常用的0.25%胰蛋白酶溶液可以很輕松地將對蝦細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，但是消化下來的細(xì)胞難以貼壁，大量死亡。然

10、而，當(dāng)胰蛋白酶溶液濃度降為0.125%時(shí)，在細(xì)胞脫壁率為80%~90%條件下，對蝦細(xì)胞的再貼壁率明顯提高，可達(dá)45.7±1.0%。但是，更低濃度的胰蛋白酶溶液（0.05%）需要更長的消化時(shí)間（10分鐘），細(xì)胞的脫壁率才能達(dá)到60%~69%，而細(xì)胞的再貼壁率也相對較低（21.0±2.0%）。其它五種消化酶溶液包括膠原酶II、中性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶E和彈性蛋白酶的消化效果很差，消化時(shí)間都相對較長（20~35分鐘），細(xì)胞的脫壁率大

11、約為60%~79%，細(xì)胞的再貼壁率大都在10%~20%之間，只有1mg·mL-1的膠原酶II的貼壁率較好，可達(dá)36.2±7.3%。4℃PBS冷處理和細(xì)胞刮刮洗法單獨(dú)使用時(shí)，傳代效果都較差，細(xì)胞的再貼壁率都約為25%左右。由于體外培養(yǎng)對蝦淋巴細(xì)胞無明顯的增殖現(xiàn)象，因而傳代使得培養(yǎng)細(xì)胞的密度不斷降低。因此，目前采用HyQTase和ECDS分別與4℃PBS處理相結(jié)合的消化方法僅能將對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)傳代2次，此后細(xì)胞開始退化、脫壁甚

12、至死亡。
　　最后，本文探索了對蝦淋巴細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法都可以將外源基因?qū)爰?xì)胞，是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞常用的方法。c-Myc基因是誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之一，是調(diào)控細(xì)胞生長增殖和永生性轉(zhuǎn)化的重要基因。本文采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法分別將鼠源c-Myc基因?qū)雽ξr淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中，并分別提取轉(zhuǎn)染pMXs-c-Myc質(zhì)?；蚪臃N含c-Myc基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒4天后的對蝦

13、細(xì)胞基因組和總RNA，然后以c-Myc基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測c-Myc基因的整合與表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（1）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可以將c-Myc基因?qū)氲綄ξr淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中，但是不能檢測到c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這可能是由于表達(dá)質(zhì)粒pMXs-c-Myc的啟動(dòng)子為細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子CMV，在對蝦細(xì)胞中不能有效轉(zhuǎn)錄表達(dá)。（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法沒有成功將c-Myc基因?qū)氲綄ξr淋巴細(xì)胞中，也沒有檢測到c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

14、。這可能是由于對蝦細(xì)胞缺乏哺乳動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒的受體，因而不能介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒在對蝦細(xì)胞中的侵染和轉(zhuǎn)移所致。
　　為了驗(yàn)證以上結(jié)論，本文還采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法分別將報(bào)告基因質(zhì)粒pMCs-GFP導(dǎo)入對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中，以觀察GFP的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（1）未轉(zhuǎn)染GFP基因的對照組中，接種后的對蝦淋巴組織塊在熒光顯微鏡下有明顯的綠色本底熒光，而遷移生長出來的淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)的前4天內(nèi)觀察不到明顯的綠色熒光，第5天開始

15、出現(xiàn)微弱的綠色本底熒光，并在隨后的培養(yǎng)過程中一直存在。因此，在對蝦細(xì)胞的轉(zhuǎn)GFP基因?qū)嶒?yàn)中，熒光觀察的時(shí)間要在前4天進(jìn)行，之后，則要考慮本底熒光的亮度。（2）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染組的對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中，未觀察到GFP的表達(dá)。這與c-Myc基因轉(zhuǎn)染的結(jié)果相一致。
　　綜上所述，本文以1.5×L-15為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加一定的營養(yǎng)成分配制的對蝦培養(yǎng)基III可以成功獲得狀態(tài)好、遷出快、壽命長且有WSSV敏感性的對蝦淋巴組織原

16、代培養(yǎng)細(xì)胞。HyQTase和ECDS分別與4℃PBS處理相結(jié)合的消化方法是對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞單層的有效傳代方法，并能成功傳代2次。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可以將c-Myc基因?qū)氲綄ξr淋巴組織原代培養(yǎng)細(xì)胞中，但是不能檢測到c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法沒有成功將c-Myc基因?qū)氲綄ξr淋巴細(xì)胞中，也沒有檢測到c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，利用這兩種方法介導(dǎo)報(bào)告基因GFP導(dǎo)入對蝦細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相一致。本文的研究結(jié)果為對蝦體外培養(yǎng)細(xì)胞