細(xì)胞培養(yǎng)

1、1.器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。具體步驟：1.1水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.1.2PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，DHanks液的配制)：1.2.1溶解定容：將藥品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃

2、棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。1.2.2移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。1.3胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8

3、.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2、Mg2和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2、Mg2的BSS，如：DHanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。1.3.1稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D

4、hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。1.3.2用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于20℃保存以備使用。1.4青、鏈霉素溶液的配制于消毒1.4.1所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。1.4.2具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。1.4.3使用時(shí)

5、溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位ml。1單位＝1微克1.5RPMI1640的制備與消毒：1.5.1溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積23的雙蒸水中并用雙蒸水沖洗包裝袋23次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中)充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙獠凑瞻b說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml使青鏈霉素的濃度最終各為100單位ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至10

6、00ml，搖勻。1.5.2安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。1.5.3抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。1.5.4分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。1.5.5使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。1.6血清的滅活：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中

7、滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。1.7HEPES溶液：HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’ahydroxythylpiperazineN’ethanesulfanicacid）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為1050mmolL，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmolLHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1molLHEPE緩沖液配制方法如下：2.1.5準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)

8、瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。2.1.6取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。2.1.7從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。2.1.8打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。2.2胰蛋白酶消化；2.2.1加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，

9、最佳消化溫度是37℃。2.2.2顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。2.2.3吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。2.3吹打分散細(xì)胞：2.3.1吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2.3.2吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。2.3.3平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)分鐘離心6～8分鐘。2.3

10、.4棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。2.4分裝稀釋細(xì)胞：2.4.1分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至23個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2.4.2顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5105ml。最后要做好標(biāo)記。2.5繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼

11、附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：2.5.1嚴(yán)格的無(wú)菌操作2.5.2適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.2

12、0g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。2.6細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作2.6.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：2.6