內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存的研究.pdf

1、內(nèi)蒙古絨山羊產(chǎn)于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市、阿拉善盟和巴彥淖爾盟，具有繁殖力高，適應(yīng)性強，產(chǎn)絨量多，絨毛細等特點。用冷凍精液通過人工授精技術(shù)可以加速優(yōu)良種群擴繁，加快絨山羊良種化進程。但是由于山羊精子的生理特點，其冷凍效果自然很低，目前仍未形成一種有效的冷凍保存技術(shù)程序。
　　為了進一步改善絨山羊冷凍精液品質(zhì)，本研究在改進絨山羊冷凍方法與優(yōu)化冷凍稀釋液方法進行了研究，以精子活率、質(zhì)膜完整性、線粒體活性、頂體完整率和DNA完整性等為檢測指標(biāo)，

2、利用熒光顯微鏡結(jié)合流式細胞術(shù)以及一些常規(guī)檢測手段對精子品質(zhì)進行了客觀有效的評價，目的是研究出適合內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存的稀釋液配方和冷凍程序。為絨山羊精液冷凍的實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　本論文主要分五個部分對精子冷凍技術(shù)進行了研究，結(jié)果如下：
　　1.對精液冷凍程序進行了系統(tǒng)優(yōu)化研究。結(jié)果表明：（1）稀釋比例1：3（v/v），去除精漿，一步法稀釋，采用緩慢降溫法(降溫前在室溫下靜置10 min),降溫3 h；（2）平衡后放在

3、距液氮面4㎝處薰蒸，時間為10 min；（3）用較高溫度解凍，55℃水浴6 s；解凍后精液放入37℃水浴鍋內(nèi)孵育10 min，精子復(fù)蘇后進行指標(biāo)的評價冷凍效果最優(yōu)。
　　2.通過逐步法對國內(nèi)外9種較好的稀釋液進行篩選，篩選出最好的基礎(chǔ)液為D組（Tris3.07g、檸檬酸1.64g、葡萄糖0.5g、果糖0.66g，卵黃5％），平均活率達41.21%，頂體完整率和質(zhì)膜完整性平均分別為75%、62.27%，效果顯著優(yōu)于其他組（p<0.0

4、5）。
　　3.不同添加成分對精子冷凍效果的研究。篩選出三類物質(zhì)的最優(yōu)成分和添加量：（1）糖類在稀釋液中屬于非滲透性冷凍保護劑，在稀釋液中具有維持滲透壓和給精子供能等主要作用，在蔗糖、海藻糖和葡聚糖3種糖的添加比較研究中確定海藻糖能有效的提高精子解凍后的質(zhì)量，添加后活力平均達到0.44，優(yōu)于其他組（p<0.05），最佳添加終濃度為62.5mM；（2）研究4種滲透性抗凍劑對精液冷凍的效果。結(jié)果表明：甘油對精子的冷凍保護效果最佳，平均

5、活率0.42，優(yōu)于其他組（p<0.05），添加濃度5%（v/v）；（3）稀釋液中添加抗氧化劑的效果研究。抗氧化劑具有清除精子代謝產(chǎn)生的活性氧簇ROS和減弱不飽和脂防酸的氧化等作用，關(guān)于L-谷氨酸、β-巰基乙胺、亞?；撬岬膱蟮垒^少，本試驗在 D組稀釋液的基礎(chǔ)上，研究3種不同濃度的抗氧化劑對山羊精子冷凍效果的影響。結(jié)果表明，3種抗氧化劑對冷凍后精子活率都顯著提高（p<0.05），但L-谷氨酸對山羊精子的冷凍保護效果比β-巰基乙胺和亞?；撬崦?/p>

6、顯（p<0.05），添加L-谷氨酸后活率平均達到0.48，最佳添加濃度為5 mM。
　　3.不同添加成分對精子冷凍效果的研究。篩選出三類物質(zhì)的最優(yōu)成分和添加量：（1）糖類在稀釋液中屬于非滲透性冷凍保護劑，在稀釋液中具有維持滲透壓和給精子供能等主要作用，在蔗糖、海藻糖和葡聚糖3種糖的添加比較研究中確定海藻糖能有效的提高精子解凍后的質(zhì)量，添加后活力平均達到0.44，優(yōu)于其他組（p<0.05），最佳添加終濃度為62.5mM；（2）研究4

7、種滲透性抗凍劑對精液冷凍的效果。結(jié)果表明：甘油對精子的冷凍保護效果最佳，平均活率0.42，優(yōu)于其他組（p<0.05），添加濃度5%（v/v）；（3）稀釋液中添加抗氧化劑的效果研究?？寡趸瘎┚哂星宄哟x產(chǎn)生的活性氧簇ROS和減弱不飽和脂防酸的氧化等作用，關(guān)于L-谷氨酸、β-巰基乙胺、亞?；撬岬膱蟮垒^少，本試驗在 D組稀釋液的基礎(chǔ)上，研究3種不同濃度的抗氧化劑對山羊精子冷凍效果的影響。結(jié)果表明，3種抗氧化劑對冷凍后精子活率都顯著提高（p

8、<0.05），但L-谷氨酸對山羊精子的冷凍保護效果比β-巰基乙胺和亞牛磺酸明顯（p<0.05），添加L-谷氨酸后活率平均達到0.48，最佳添加濃度為5 mM。
　　4.本實驗用AO(吖啶橙)染色方法研究冷凍前后精子的DNA完整性，分析冷凍是否對精子 DNA造成進一步的損害，海藻糖在山羊精子冷凍-解凍過程中可以改善精子的質(zhì)量，對精子DNA的完整性的保護作用優(yōu)于其他組（p<0.05）；細管凍精在高倍稀釋與低倍稀釋相比，可明顯增加解凍后

9、精子DNA的損傷程度，通過精子細胞的TUNEL凋亡測定，冷凍前后對精子DNA的損傷程度不明顯或不顯著（p>0.05）。但添加保護劑后可加劇DNA的損傷程度（p<0.05）。
　　5.為了最大限度地利用優(yōu)良種山羊的遺傳資源，進一步研究了附睪精子的冷凍效果，通過對山羊附睪精子的冷凍效果研究，結(jié)果表明：山羊附睪精子能夠成功地冷凍保存，冷凍效果優(yōu)于射出精子的冷凍效果，冷凍后活率平均達0.55。
　　綜上所述，本實驗通過篩選內(nèi)蒙古白絨