廣東商品紅菇形態(tài)和分子鑒定、營(yíng)養(yǎng)成分分析及其生物活性研究.pdf

1、廣東梅州商品紅菇屬于紅菇目紅菇科紅菇屬，是一種美味的野生菌根性食用菌。該菇味道香甜，口感脆滑，在廣東梅州地區(qū)有多年食用的歷史，市場(chǎng)交易規(guī)模較大。紅菇屬真菌形態(tài)變異很大，以至于該屬的分類一直比較混亂，廣東梅州商品紅菇的分類長(zhǎng)期存在著爭(zhēng)議。本論文通過(guò)野外生態(tài)因子調(diào)查，子實(shí)體、菌根、孢子等形態(tài)顯微觀察，結(jié)合：DNA中內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及大亞基(LSU)序列分析，首次對(duì)廣東梅州商品紅菇進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定；進(jìn)一步系統(tǒng)測(cè)定和分析了該商品紅

2、菇營(yíng)養(yǎng)成分及功能成分；運(yùn)用濾紙片擴(kuò)散法評(píng)價(jià)了該紅菇抗菌活性并通過(guò)GC—MS聯(lián)用分析了該紅菇揮發(fā)油及石油醚萃取物的化學(xué)成分：然后采用四種抗氧化測(cè)定方法評(píng)價(jià)了該紅菇的抗氧化作用，檢測(cè)了其抗氧化活性成分，研究了該商品紅菇的抗氧化活性與黃酮和多酚含量的相關(guān)性，以及初步探討其清除自由基的作用機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1)廣東梅州商品紅菇形態(tài)顯微觀察
　　 通過(guò)野外生態(tài)調(diào)查和顯微鏡技術(shù)分別對(duì)廣東梅州商品進(jìn)行了生態(tài)學(xué)和組織

3、學(xué)研究。結(jié)果表明，廣東梅州商品是一種外生菌根菌，在相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境條件下，出菇的最適氣溫是24—32℃，相對(duì)空氣濕度達(dá)80％～100％，土壤含水量達(dá)到40％以上，濕度是主導(dǎo)因子。每年在夏末秋初高溫陣雨之后為發(fā)生盛期，發(fā)生地林間郁閉度0.9左右，土壤pH值3～4，其共生樹(shù)種為殼斗科植物。廣東梅州商品紅菇顏色以紅色為主，囊狀體特別發(fā)達(dá)，菌肉灰色，菌髓為異型菌髓，擔(dān)孢子近球形，孢子大小為8.55—10.29×10.65～11.01μm，孢子

4、表面有脊?fàn)钔黄穑涓叨燃s1.14μm，寬0.57μm，相鄰脊間最寬距離2.14μm。確證該商品紅菇菌絲細(xì)胞與細(xì)胞連接處沒(méi)有鎖狀聯(lián)合。
　　 2)廣東梅州商品紅菇分子鑒定
　　 實(shí)驗(yàn)采用核酸序列分析法，對(duì)采自廣西浦北、福建上杭和廣東梅州的8個(gè)商品紅菇子實(shí)體的rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer)以及28S rDNA區(qū)段進(jìn)行克隆測(cè)序和序列特征比較分析，并對(duì)rDNA ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)

5、據(jù)庫(kù)GenBank同源性檢索比對(duì)，將從GeneBank檢索獲得的相似物種rDNA ITS以及28S rDNA區(qū)段序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。rDNAITS序列比較結(jié)果表明，8個(gè)紅菇屬菌株的rDNAITS序列長(zhǎng)度為681 bp～699 bp，GC含量為48.56％～49.64％，子實(shí)體R1、R2、R3、R6和R8的rDNA ITS區(qū)段與GenBank中已知灰肉紅菇(Russulagrmeocarnosa)的相似率達(dá)99％，其余幾株與灰肉紅菇的相似

6、率低于95％。由此推斷，從廣西浦北和廣東梅州隆文采集的商品紅菇子實(shí)體是灰肉紅菇，但在廣東梅州、福建上杭產(chǎn)區(qū)可能存在多種食用紅菇共同生長(zhǎng)。
　　 對(duì)多種紅菇屬真菌的ITS序列和LSIU序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究表明，8株不同產(chǎn)地(來(lái)源)的紅菇聚在一起，表明它們之間有相對(duì)較密切的親緣關(guān)系。從ITS序列構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，R1、R2、R6、R7與R.Griseocarnosa聚成一支，R3、R4、R5、R8與R.Emetica聚在一起。從

7、LSU序列構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，8個(gè)紅菇屬菌株與Russula vinosa聚成一支。無(wú)論是ITS序列還是LSU序列構(gòu)造的發(fā)育樹(shù)均證明所測(cè)的各菌株之間大多存在一定的變異。
　　 3)灰肉紅菇營(yíng)養(yǎng)成分分析
　　 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)采自廣東梅州隆文灰肉紅菇的一般營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明：菌蓋和菌柄中粗蛋白，粗脂肪，粗纖維，灰分，還原糖，碳水化合物含量分別為32.31％，19.10％；7.17％，5.18％；8.85％，11.

8、72％：7.84％，6.59％；2.11％，1.97％：49.10％，62.68％。
　　 采用氨基酸分析儀、原子吸收分光光度計(jì)、HPLC、GC/MS等方法對(duì)灰肉紅菇的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)一步分析結(jié)果表明：灰肉紅菇子實(shí)體中含有磷、鉀、鐵、鈉、鈣、鎂、鋅等多種具有生理活性的礦物質(zhì)元素。子實(shí)體菌蓋和菌柄中K/Na比分別高達(dá)14.78和31.7。菌蓋和菌柄中都含有7種脂肪酸，主要是油酸、亞油酸和棕櫚酸，子實(shí)體菌蓋中油酸含量最高，為47.92％;

9、菌柄中亞油酸含量最高，為50.22％。全氨基酸分析表明含有17種氨基酸，菌蓋和菌柄中氨基酸總量不同，分別占子實(shí)體干重的12.75％和8.98％。人體必需的7種氨基酸齊全(色氨酸未測(cè))，菌蓋和菌柄中必需氨基酸分別占氨基酸總量的46.04％和52.18％。
　　 4)灰肉紅菇抗菌活性
　　 利用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)灰肉紅菇抗菌活性進(jìn)行了研究并通過(guò)GC-MS聯(lián)用分析了灰肉紅菇揮發(fā)油及石油醚萃取物的化學(xué)成分。結(jié)果表明：灰肉紅菇中揮發(fā)油

10、對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌以及沙門氏菌均有明顯的抑制作用。石油醚萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌有明顯的抑制作用。子實(shí)體乙醇提取物總體抑菌作用不明顯?；胰饧t菇揮發(fā)油中的主要化學(xué)成分為酮、烷烴、醛、烯烴等化合物，而石油醚萃取物主要成分為酸、酯、烯烴、醇等化合物。
　　 5)灰肉紅菇抗氧化活性的測(cè)定
　　 從還原能力、DPPH清除率等和對(duì)不同體系產(chǎn)生的活性氧自由基清除效果等方面對(duì)灰肉紅菇提取物的抗

11、氧化活性進(jìn)行了試驗(yàn)研究和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明灰肉紅菇提取物具有較強(qiáng)的還原能力，對(duì)DPPH、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基的抑制作用或清除作用，以及通過(guò)螯合金屬來(lái)抑制金屬對(duì)脂質(zhì)氧化的催化作用。通過(guò)抗氧化性與總酚和黃酮相關(guān)性分析表明：還原力與總酚含量相關(guān)
　　 (R2=0.7831)，清除DPPH自由基與黃酮含量相關(guān)(R2=0.816)，還原力與黃酮含量相關(guān)(R2=0.8527)，可知黃酮的抗氧化能力主要體現(xiàn)在還原力上。
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12、)抗氧化活性成分的檢測(cè)
　　 采用依利特Hypersil BDS-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm))，甲醇-0.1％磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，SPM-M10AVP紫外檢測(cè)器，25℃柱溫，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm的高效液相色譜法對(duì)灰肉紅菇提取物抗氧化活性成分-酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)。以5種不同黃酮類化合物和8種酚酸為對(duì)照品，檢測(cè)出灰肉紅菇中咖啡酸、槲皮素以及原兒茶酸3種抗氧化活性物質(zhì)，