石斛蘭試管開花及其分子機制研究.pdf

1、石斛蘭（Dendrobium）是一種具有較高觀賞價值的熱帶蘭花。本研究以春石斛和鐵皮石斛原球莖為材料，進行石斛蘭離體再生體系優(yōu)化、試管開花研究，花器官發(fā)育相關基因LRR-RLK基因克隆及其在試管開花過程中的定量表達研究。主要結果如下：
　　 1.石斛蘭離體再生體系的優(yōu)化
　　 以保存5年的春石斛原球莖為材料，采用L9(34)正交試驗設計，比較不同NH4+-N:NO3-N比值、6-BA濃度以及香蕉勻漿物濃度對原球莖增殖的影

2、響，結果表明：KC+6-BA1.0mg/L+香蕉勻漿物10g/L最適宜春石斛原球莖的增殖，其中香蕉勻漿物對其影響最大，最適宜的濃度為10g/L;以保存5年的春石斛和鐵皮石斛原球莖為材料，采用L9(34)正交試驗設計，比較不同濃度的6-BA、白糖和香蕉（或椰汁）對其壯苗生根條件的優(yōu)化，結果表明：香蕉添加物比椰汁更能促進春石斛試管苗的壯苗生根，適宜春石斛壯苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0mg/L+白糖20g/L+香蕉50g/L，而對于

3、鐵皮石斛，椰汁更有利于其壯苗生根，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0mg/L+白糖30g/L+椰汁100mL/L更適宜鐵皮石斛試管苗的壯苗生根。
　　 2．石斛蘭試管開花研究
　　 從不同培養(yǎng)基、不同濃度6-BA、改良培養(yǎng)基、不同濃度ZT、TDZ、不同濃度馬鈴薯添加物等單因子以及這些因子結合使用對春石斛試管苗開花的條件進行了研究。結果表明：多因子比單因子更容易促進春石斛試管苗的開花，而且多因子結合使用更容易獲得正常的試管

4、花，改MS(1/10N，NH4+-N:NO3-N為4:1)+TDZ0.1mg/L+白糖20g/L+CW100mL/L+PP3331.0mg/L，14℃低溫處理20d為春石斛試管苗花芽誘導率最高的處理，誘導率達到31.91％，NH4+-N:NO3-N、N、TDZ、PP333、糖、椰汁、低溫和PP333對花芽誘導率的影響均達到顯著水平，而改MS（1/10N,NH4+-N:NO3-N為2:1,5P）+TDZ0.2mg/L+白糖40g/L+CW

5、100mL/L+PP3331.0mg/L,14℃低溫處理30d為春石斛正常試管花的誘導培養(yǎng)基，各因素對其影響程度依次為：糖＞PP333＞低溫＞P＞TDZ=椰汁＞NH4+-N:NO3-N＞N。
　　 從不同濃度的6-BA和TDZ對鐵皮石斛試管苗花芽誘導的影響進行了研究。結果表明：TDZ比6-BA更適宜鐵皮石斛試管苗花芽的誘導，最適培養(yǎng)基為1/2MS+TDZ0.2mg/L+CW100mL/L+白糖20mg/L，花芽誘導率最高達到94

6、.79％（以花芽統(tǒng)計）和62.50％（以開花的試管苗統(tǒng)計）。
　　 3．春石斛原球莖LRR-RLK基因的克隆以春石斛原球莖為材料，提取總RNA，進行春石斛LRR-RLK基因克隆研究。試驗結果表明：使用通用植物總RNA提取試劑盒提取的RNA條帶清晰、明亮，但有DNA污染；改進的Trizol試劑法提取的結果雖不穩(wěn)定，易降解，但無DNA污染，純度較高，在不同的試驗階段應根據試驗要求選擇不同的方法提取石斛蘭總RNA。根據已有其它植物LR

7、R-RLK基因保守區(qū)序列設計一對引物，用RT-PCR擴增出特異片段，得到了春石斛保守區(qū)和3’端序列，整個片段長1034bp，并得到一個由531個堿基組成的開放閱讀框，編碼176個氨基酸，通過核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比對發(fā)現：春石斛LRR-RLK基因的核苷酸序列與已登錄的其它植物LRR-RLK基因同源性較高，最高達到74％；而其編碼的氨基酸序列與多種物種均達到90％以上。已經在GenBank上登錄，登錄號為GU357498.1。

8、
　　 4．春石斛試管苗開花過程中LRR-RLK基因表達的熒光定量PCR分析
　　 采用熒光定量PCR技術，對春石斛試管苗開花過程中LRR-RLK基因在mRNA水平上的表達進行了定量研究。試驗首先克隆了內參基因EF-lα，得到了長716bp的片段，編碼237個氨基酸序列，通過核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比對發(fā)現春石斛EF-lα基因的核苷酸序列與已登錄的其它植物EF-lα基因同源性非常高，適宜作為熒光定量表達過程中的

9、內參基因的待選基因。已經在GenBank上登錄，登錄號為GU382674.1。對2個待選內參基因EF-lα基因和18SrRNA基因進行了篩選比較，結果表明:18SrRNA更適宜作為春石斛LRR-RLK基因定量表達分析的內參基因。對春石斛離體開花過程中LRR-RLK基因的定量表達分析表明：在原球莖階段，LRR-RLK基因表達量較高，在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成幼苗后逐漸升高，當把幼苗轉入花芽誘導培養(yǎng)基中之后，表達量逐漸降低，直到形成花芽時降到