寡雄腐霉RCU1菌株及寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄抗病性的研究.pdf

1、寡雄腐霉PythiumoligandrumDrechsler是一種土壤習(xí)居型腐生菌,它能在多種農(nóng)作物根圍定殖,能拮抗或寄生20多種植物病原菌,拮抗機制主要包括真菌寄生、抗生作用和誘導(dǎo)抗性等。寡雄腐霉對植物無毒性,對環(huán)境安全。寡雄蛋白(oligandrin)是寡雄腐霉產(chǎn)生的一種擬激發(fā)素蛋白,對番茄植株本身無毒性,不會引起番茄產(chǎn)生過敏性反應(yīng)壞死斑,能誘導(dǎo)番茄對多種蔬菜重要病害產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性。本文在溫室生產(chǎn)環(huán)境下,在番茄根部施用寡雄蛋白,系

2、統(tǒng)地研究了寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄葉片對灰霉病的抗性及其機理,進一步應(yīng)用熒光定量PCR的方法探明經(jīng)寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性與病程相關(guān)蛋白的關(guān)系,以及誘導(dǎo)抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;并制備了寡雄蛋白的多克隆抗體,應(yīng)用免疫膠體金標記技術(shù)對寡雄蛋白在植株中的傳遞途徑、作用位點等進行了亞細胞定位,主要研究結(jié)果如下:
　　 1、寡雄腐霉菌株RCU1及其分泌物的抑菌作用及對番茄灰霉病的防效
　　 應(yīng)用玻璃紙法和生長速率法測定了寡雄腐霉菌

3、株RCU1分泌物對9種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明,該分泌物對供試的9種植物病原真菌菌絲生長均有抑制作用;分子量小于8KD的寡雄腐霉分泌物能強烈抑制森禾腐霉、灰葡萄孢、黃色鐮刀菌的菌絲生長,抑菌率分別達到88.9％、86.7％和84.6％,對供試的四種腐霉以及尖孢鐮刀菌的4個專化型的抑菌率均達顯著性差異。在掃描電鏡下可見,經(jīng)寡雄腐霉分泌物處理的灰葡萄孢,菌絲細胞破裂、穿孔、干癟,且菌絲分化出的分生孢子梗少,產(chǎn)孢量明顯下降。溫

4、室盆栽試驗表明,寡雄腐霉濾液對番茄灰霉病具有顯著的預(yù)防保護作用和治療作用,其預(yù)防保護作用與殺菌劑50％多菌靈可濕性粉劑1000倍液的防治效果達到同一顯著水平。
　　 2、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄苗對灰霉病的抗性及機理研究
　　 溫室盆栽實驗表明,寡雄蛋白(10μg/mL)處理番茄苗根系能夠誘導(dǎo)番茄葉片對灰霉病的抗性,誘抗效果對供試品種合作903和凱特2號無顯著差異。寡雄蛋白番茄根部誘導(dǎo)24h后接種灰葡萄孢,保護作用達61.3％,

5、治療效果可達51.8％;應(yīng)用熒光定量PCR的方法研究了寡雄蛋白對番茄葉片基因表達量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白根部處理24h,誘導(dǎo)番茄葉片病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶和-β-1,3葡聚糖酶基因表達量分別比對照增強4.7倍和3.1倍。
　　 寡雄蛋白處理番茄根系24h后接種灰葡萄孢,處理后3d及5d木質(zhì)素含量比接種灰葡萄孢對照分別升高18.5％和34.4％(合作903),22.3％和27.6％(凱特2號);番茄葉片POD、PPO、PAL活性

6、均明顯高于接種灰葡萄孢對照,峰值較對照高20.0％,32.6％,57.1％(合作903),43.9％、32.6％、41.5％(凱特2號)。誘導(dǎo)番茄植株防御酶活性的提高,調(diào)控體內(nèi)次生物質(zhì)代謝,誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因表達量的上調(diào),可能是寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄葉片抵御灰霉病的主要機理。
　　 3、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　 應(yīng)用熒光定量PCR的方法研究了寡雄蛋白對番茄葉片的基因表達量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白根部處理

7、可誘導(dǎo)番茄葉片乙烯反應(yīng)因子ERF2和茉莉酸(JA)相關(guān)因子PR6基因表達量分別比對照增強6.6倍和3.6倍,寡雄蛋白誘導(dǎo)對番茄灰霉病的系統(tǒng)抗性依賴于ISR中的JA和ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;寡雄蛋白根部處理24h,誘導(dǎo)番茄葉片病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶基因表達量分別比對照增強4.7倍和3.1倍,表明寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄對灰霉病的抗性同時具有ISR和SAR的部分特征。寡雄蛋白可能是通過水楊酸(SA)協(xié)同JA/乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)番茄對灰

8、霉病的抗性。
　　 4、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄果實對灰霉病的抗性及機理研究
　　 寡雄蛋白(10μg/mL)處理番茄果蒂處24h后在番茄果肩處接種灰葡萄孢,常溫下寡雄蛋白處理的番茄果實腐爛率比對照降低了49.5％。常溫貯藏結(jié)束時,寡雄蛋白處理番茄的細胞質(zhì)膜相對透性比對照低63％;MDA產(chǎn)生量比對照降低31％。寡雄蛋白處理番茄果實PAL、PPO和POD活性峰值比接種處理高18.8％,20.0％和22.7％。應(yīng)用熒光定量PCR的方

9、法研究了寡雄蛋白對番茄果實基因表達量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白處理的番茄果實PR-2a和PR-3a基因表達量比對照升高2.7倍和3.6倍。誘導(dǎo)番茄防御酶活性的提高,維持細胞結(jié)構(gòu)的完整性,誘導(dǎo)PR-2a和PR-3a基因表達量的升高,是寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄果實抵御灰霉病的關(guān)鍵。
　　 5、寡雄蛋白與寄主植物互作的細胞化學(xué)定位
　　 制備了寡雄蛋白的多克隆抗體,應(yīng)用免疫膠體金標記技術(shù)對寡雄蛋白在寡雄腐霉菌絲中、寡雄腐霉在番茄根部定

10、殖以及寡雄蛋白在番茄葉片中的移動進行亞細胞定位,結(jié)果表明,PDA平板或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的寡雄腐霉菌絲中,寡雄蛋白主要積累在菌絲細胞壁,可以分泌到寡雄腐霉細胞外,表明寡雄蛋白是一種外泌蛋白。
　　 免疫膠體金標記結(jié)果表明,寡雄腐霉在番茄根部定殖4h即可在番茄根部細胞中檢測到寡雄蛋白,隨著時間的推移,寡雄蛋白的量逐漸增加,在根組織細胞的細胞壁、葉綠體等處聚集。菌絲中合成的寡雄蛋白主要束縛在菌絲壁上,而菌絲內(nèi)部較少,說明寡雄蛋白合成后

11、很快分泌出去,而不是在成熟的菌絲中積累。寡雄腐霉接種24h即可在番茄根組織細胞內(nèi)檢測到大量寡雄蛋白,表明番茄是寡雄腐霉的適宜寄主,寡雄腐霉可以大量在番茄根部定殖,分泌寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)獲得抗性。
　　 寡雄蛋白處理番茄中部葉片,免疫膠體金標記結(jié)果表明,4h后番茄上、中、下部葉片細胞壁和細胞核中均有大量寡雄蛋白存在,表明寡雄蛋白可在植物體內(nèi)進行上下轉(zhuǎn)運。寡雄蛋白可能是從侵入部位傳導(dǎo)到植物其他部位并激發(fā)系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)的信號,其信