雄烯二酮高產(chǎn)菌株的誘變育種及發(fā)酵性能研究.pdf

1、雄烯二酮(AD)是制備甾體激素類藥物的重要中間體，可通過(guò)微生物選擇性切除植物甾醇側(cè)鏈制得。微生物法制取AD具有產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低、周期短等特點(diǎn)，但也存在菌種轉(zhuǎn)化能力普遍不高，底物甾醇在水中溶解度低等缺點(diǎn)。針對(duì)上述問(wèn)題，本文通過(guò)誘變育種篩選出一株．AD高產(chǎn)突變株分枝桿菌Mycobacterium sp．BD696-6，顯著提高了AD產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，并且以有機(jī)相一水相兩液相培養(yǎng)系統(tǒng)作為發(fā)酵系統(tǒng)，明顯提高了甾體底物的投料量。同時(shí)，研究了培養(yǎng)

2、基組成以及發(fā)酵條件對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。 研究的主要結(jié)論有： (1)采用紫外線誘變、硫酸二乙酯誘變以及兩者復(fù)合誘變方法對(duì)分枝桿菌Mycobacterium sp.BD696進(jìn)行誘變，篩選得到一株AD高產(chǎn)突變株分枝桿菌Mycobacterium sp.BD696-6，在甾醇添加量為6‰時(shí)，AD濃度最終達(dá)到2.33g/L，AD轉(zhuǎn)化率為61.4％，比出發(fā)菌株提高13.5％。連續(xù)傳代5次，生產(chǎn)穩(wěn)定性良好。 (2)通過(guò)單因素實(shí)

3、驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定兩相系統(tǒng)中有機(jī)相葵花油最佳添加濃度為20％，水相培養(yǎng)基最佳C、N、P源以及金屬離子種類和濃度分別為：糖蜜6％，NH<,4>NO<,3> 0.3％，(NH<,4>)<,2>HPO<,4> 0.08％，F(xiàn)eSO<,4>·7H<,2>O 0.05 g/L，ZnSO<,4>·7H<,2>O 0.3g/L，MgSO<,4>·7H<,2>O 0.2 g/L在最佳培養(yǎng)基條件下以及甾醇添加量為6960時(shí)，AD轉(zhuǎn)化率達(dá)到84.0％，比原

4、培養(yǎng)基條件下的轉(zhuǎn)化率提高了22.4％。 (3)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了搖瓶發(fā)酵階段的最適發(fā)酵條件是：液體種子培養(yǎng)時(shí)間66h，接種量12％，裝液量50mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，溫度30～32℃，初始pH7.5。 (4)在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行的放大培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證了搖瓶發(fā)酵的高轉(zhuǎn)化率。AD的轉(zhuǎn)化率隨著甾醇添加量的提高而有所降低，但總產(chǎn)量明顯提高。甾醇添加量在8％0時(shí)，AD轉(zhuǎn)化率在108h達(dá)到最高97.1％，此時(shí)產(chǎn)