奶牛乳腺炎的病原菌分離鑒定、毒力基因檢測(cè)與基因治療研究.pdf

1、乳腺炎一直是危害奶牛業(yè)的重要疾病，但隨著抗生素的長(zhǎng)期和盲目使用，其防治難度越來越大。為了深入調(diào)查奶牛乳腺炎的病原，該研究從江蘇省5個(gè)牛場(chǎng)采集了100份臨床顯性和隱性乳腺炎奶樣，并進(jìn)行了細(xì)菌分離與生化鑒定。結(jié)果顯示在乳腺炎患牛奶樣中，大腸桿菌的分離率最高(82％)，其次是乳房鏈球菌(53％)、金黃色葡萄球菌(41％)、停乳鏈球菌(29％)和無乳鏈球菌(27％)。在臨床顯性乳房炎中，乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的混合感染普遍，而且以前認(rèn)為無致

2、病性的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌也占一定比例(分別為15％和10％)。選用16種針對(duì)革蘭氏陽性菌的抗生素，對(duì)30株乳房鏈球菌、20株無乳鏈球菌、10株停乳鏈球菌和40株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示大多數(shù)鏈球菌菌株對(duì)米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星高度敏感，對(duì)臨床常用的復(fù)方新諾明、苯唑青霉素等具有較高的耐藥性；大多數(shù)金黃色葡萄球菌對(duì)萬古霉素和壯觀霉素高度敏感，對(duì)臨床常用的呋喃妥因、氯霉素、米諾環(huán)素等具有較高的耐藥性。
　　 為了

3、研究致奶牛乳腺炎大腸桿菌的毒素基因、毒力島基因、粘附素基因、溶血素基因、外膜蛋白基因等分子流行病學(xué)，對(duì)分離自江蘇5個(gè)奶牛場(chǎng)的123株致奶牛乳房炎大腸桿菌進(jìn)行了相關(guān)毒力因子的PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示從76株(61.8％)致奶牛乳房炎大腸桿菌中檢測(cè)到毒素基因(LT1、ST1、ST2、Cnf1、Cnf2)，其中LT1+占17.1％，ST2+24.4％，Cnf2+占20.3％，未檢測(cè)到ST1、Cnf1毒素基因；從68株(55.3％)致奶牛乳房炎大腸

4、桿菌中檢測(cè)到毒力島相關(guān)基因(irp2、Ecs3703、aer)，ETT2毒力島的檢出率最高(36.6％)，其次為HPI(14.6％)，檢測(cè)率最低的為攝鐵相關(guān)基因(4.1％)；從8株(6.5％)致奶牛乳房炎大腸桿菌中檢測(cè)到粘附素相關(guān)基因(clpG、pap、sfa、afaD8、afaE8、F17b、F17a)，其中2株(1.6％)為F17a+，3株(2.4％)攜帶P菌毛，3株(2.4％)攜帶S菌毛，未檢測(cè)到攜帶非菌毛粘附素、CS31A粘附素

5、和F17b基因；在123株致奶牛乳房炎大腸桿菌中，8株(6.5％)產(chǎn)生溶血素，21株(17.1％)產(chǎn)生血清抗性因子。
　　 為了便于防治奶牛乳腺炎基因藥物的推廣應(yīng)用，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用無針頭注射器將表達(dá)人溶菌酶的重組質(zhì)粒在干乳期注射健康奶牛乳腺或泌乳期乳腺炎患牛乳腺，根據(jù)乳汁的CMT檢測(cè)結(jié)果判定防治效果。結(jié)果顯示每乳區(qū)兩次注射500微克重組質(zhì)粒，對(duì)乳腺炎的預(yù)防效果在90％以上，對(duì)泌乳期隱性乳腺炎的治療效果為81.8％，與乳腺基

6、部穿刺法的防治效果相當(dāng)，說明無針注射法能取代常規(guī)有針注射法用于奶牛乳腺炎的防治，具有無需保定、無交叉污染和效率高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)基因藥物治療奶牛乳腺炎的安全性，將15頭患隱性乳腺炎的奶牛隨機(jī)均分為3組，分別以400μg/乳區(qū)、600μg/乳區(qū)、800μg/乳區(qū)的劑量，通過乳房基部穿刺注射表達(dá)人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒p215C3LYZ，24 h后重復(fù)注射一次，觀察奶牛的精神、食欲、心率、呼吸、體溫等臨床指標(biāo)。結(jié)果顯示基

7、因治療奶牛的精神、食欲、心率、呼吸、體溫等臨床指標(biāo)在注射前后無顯著差異。另選取3頭患隱性乳腺炎的奶牛，通過乳房基部穿刺注射重組質(zhì)粒p215C3LYZ，劑量為1600μg/頭，24 h后重復(fù)注射一次，定期采集試驗(yàn)組奶牛的乳樣、糞樣、尿樣以及試驗(yàn)牛舍的墊料、水樣，用PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒在試驗(yàn)牛體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除再次注射后24h可從奶樣中檢測(cè)到重組質(zhì)粒外，其他樣品均為陰性，表明重組質(zhì)粒不能在奶牛體內(nèi)長(zhǎng)期殘留，也不能在環(huán)境中擴(kuò)散。于第二