奶牛乳腺炎大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型相關(guān)毒力基因與耐藥基因的檢測(cè)與序列分析.pdf

1、本研究利用寧夏地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株，采用O抗原平板凝集試驗(yàn)鑒定大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型，應(yīng)用紙片擴(kuò)散法對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析，運(yùn)用PCR方法對(duì)耐藥基因以及毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)血清型和耐藥性之間的關(guān)系，以及irp2、iucA兩種毒力基因的序列進(jìn)行了分析比對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)GenBank報(bào)道的序列，設(shè)計(jì)大腸桿菌16SrRNA鑒定的通用引物，應(yīng)用16SrRNA鑒定大腸桿菌的方法，鑒定本實(shí)驗(yàn)室收集到的173株臨床型

2、奶牛乳腺炎腸桿菌科細(xì)菌，最終鑒定出107株大腸桿菌。
　　2.根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取30種大腸桿菌O抗原血清，對(duì)107株奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行O抗原血清鑒定。鑒定結(jié)果表明，107株奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株中共有78株被鑒定出血清型，優(yōu)勢(shì)血清型有O101(15/78)、O158(15/78)，另外檢出較多的有O53(8/78)、O10(7/78)、O86(5/78)、O92(6/78)，占定型株的71.8％，29株未定

3、型。
　　3.采用CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法，對(duì)107株臨床型奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行了11種藥物的藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌株對(duì)11種抗菌藥物具有不同程度的耐藥性，其中對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)到94.4％，對(duì)四環(huán)素達(dá)到90.7％，對(duì)慶大霉素達(dá)到86.9％，對(duì)氨芐青霉素和阿莫西林均達(dá)到93.5％，另外對(duì)強(qiáng)力霉素，卡那霉素也達(dá)到60％以上，其他幾種藥物也達(dá)到較高水平。這107株大腸桿菌共出現(xiàn)53種耐藥譜，并未出現(xiàn)1耐、2耐以及11

4、耐的菌株。耐藥類型最少的是0耐（僅1株），最高的達(dá)到10耐。
　　4.根據(jù)GenBank報(bào)道的相關(guān)序列，設(shè)計(jì)磺胺類:sul1、sul2、sul3;四環(huán)素類:tetA、tetB、tetE;氨基糖苷類:aadA1、aadA2、aadB、aadD、aacC2、aacC4、aac(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa、aph(3)-Ⅱa;β-內(nèi)酰胺類:CTX-M、SHV、OXA、TEM;毒力基因:irp2、fyuA、eaeA、ler、F41、L

5、T1、ST1、iucA、iucB、iutA的PCR反應(yīng)特異性引物，建立了相應(yīng)的PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法靈敏可靠，可以用作臨床檢測(cè)的方法使用。對(duì)107株奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到14種耐藥基因，7種毒力基因，分別為，sul1(31.8％)、sul2(37.4％)、sul3(2.8％)、tetA(17.8％)、tetB(14.0％)、aacC2(32.7％)、aacC4(13.1％)、aadA1(9.3％)、aa

6、dA2(10.3％)、aadB(38.3％)、aac(3)-Ⅱa(27.1％)、CTX-M(10.3％)、OXA(8.4％)、TEM(47.7％)、irp2(49.5％)、fyuA(49.5％)、ler(3.7％)、eaeA(3.7％)、iucA(38.3％)、iucB(56.1％)、iutA(49.5％)。而其他8種基因未檢測(cè)到。
　　5.對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型O158、O101的30株大腸桿菌，分別擴(kuò)增其irp2以及iucA兩種基因并測(cè)

7、序，之后對(duì)其序列進(jìn)行分析，基因序列分析結(jié)果表明，兩種基因與GenBank報(bào)道的序列同源性非常高，irp2達(dá)到95.9％以上，而iucA達(dá)到98％以上。此外，兩種基因的不同序列中均出現(xiàn)規(guī)律性的突變，其中irp2基因共出現(xiàn)6種序列，其中有3種序列均出現(xiàn)279位點(diǎn)附近4個(gè)堿基的缺失以及531位點(diǎn)的AT突變?yōu)門C。全部6種序列中，都在304位點(diǎn)出現(xiàn)A突變?yōu)镃，343位點(diǎn)C突變?yōu)锳，346位點(diǎn)A突變?yōu)镚，376位點(diǎn)A突變?yōu)镃以及518位點(diǎn)的T突變