免疫層析法檢測(cè)山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條的研制.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)引起的山羊的一種高度接觸性傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告?zhèn)魅静≈?。近幾年，我國相繼在甘肅、山東等地分離或檢測(cè)到CCPP的病原體Mccp，表明該病在我國流行。準(zhǔn)確診斷是是防治該病的前提條件之一。目前，國外已報(bào)道多種CCPP血清學(xué)診斷方法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、競(jìng)爭ELISA試驗(yàn)等，但多有諸如操作復(fù)雜、重復(fù)性或特異性差、需實(shí)驗(yàn)室儀器等缺點(diǎn)，尤其不適合于我國動(dòng)物疾病

2、診斷實(shí)際中快速、易于操作和適于基層使用的要求。免疫膠體金技術(shù)具有方便快捷、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異、敏感、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀、可以保存等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)免疫診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。因此，本研究運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，建立一種快速、簡便、靈敏的檢測(cè)MCCP抗體的方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)用Mccp全菌為抗原，常規(guī)免疫健康家兔，間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)1:1024以上后收集兔血清，然后采用硫酸銨鹽析和Protein G抗體純化柱獲得兔

3、抗Mccp多克隆抗體，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測(cè)其純度；采用MEM-KM2培養(yǎng)基擴(kuò)大Mccp的培養(yǎng)，經(jīng)10000 r/min離心菌體，從上清液中提取Mccp莢膜多糖備用。
　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備25nm的膠體金顆粒，膠體金標(biāo)記純化后的Mccp，最佳標(biāo)記量和最適pH值的測(cè)定結(jié)果分別為50μg/ml和7.0，低溫超速離心法純化標(biāo)記好的金標(biāo)抗原；用純化的Mccp分泌多糖抗原包被試紙條的檢測(cè)

4、線，最適劃線濃度為2.0 mg/ml，Mccp多克隆抗體用于質(zhì)控線的包被，最適劃線濃度為1.6 mg/ml。檢測(cè)試紙條對(duì)已知陽性和陰性血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間約10 min，陽性血清在檢測(cè)線和質(zhì)控線出現(xiàn)兩條明顯的紅色條帶，檢驗(yàn)結(jié)果為陽性，而PBS在質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，在檢測(cè)線未出現(xiàn)，檢驗(yàn)結(jié)果呈陰性，與預(yù)期設(shè)計(jì)的結(jié)果相符合。
　　 對(duì)試紙條進(jìn)行了敏感性、重復(fù)性、特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：血清效價(jià)為1:1024的Mccp陽性血清稀釋80