豬肺炎支原體免疫膠體金快速診斷試紙的研制.pdf

1、豬肺炎支原體( Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS)的病原微生物。該病以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)，主要癥狀為咳嗽、氣喘、飼料的利用率低，病豬生長十分緩慢，甚至生長停滯，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此對(duì)該病及時(shí)作出診斷有利于降低經(jīng)濟(jì)損失。本研究針對(duì)目前MPS診斷耗時(shí)長的問題，運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)建立M

2、PS快速診斷方法。
　　 本研究以TritonX-100結(jié)合KI破碎支原體細(xì)胞獲得豬肺炎支原體膜蛋白粗提產(chǎn)物，粗提產(chǎn)物再通過免疫親和層析進(jìn)行純化。純化的豬肺炎支原體膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示含六條蛋白條帶，分子量分別為：83KD、66KD、40KD、36KD、34KD和27KD。用純化的豬肺炎支原體膜蛋白免疫60日齡健康家兔，獲得的兔抗豬支原體高免血清與純化的豬肺炎支原體經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散，檢測(cè)到抗血清效價(jià)為1:32。<

3、br>　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為20nm的膠體金，用紫外分光光度計(jì)的波譜掃描功能對(duì)膠體金溶液在可見光400nm-700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析，結(jié)果顯示膠體金顆粒大小均-(19.76nm)，適合免疫標(biāo)記。以制備好的膠體金標(biāo)記純化的豬肺炎支原體膜蛋白，獲得穩(wěn)定的免疫膠體金。確定標(biāo)記條件為：最佳標(biāo)記pH為8.2，純化的豬肺炎支原體膜蛋白最佳結(jié)合量為9μg/ml。用聚酯纖維素膜浸泡標(biāo)記好的免疫膠體金，干燥后制得金標(biāo)墊。同時(shí)將純化的豬

4、肺炎支原體膜蛋白和兔抗豬肺炎支原體IgG分別作為診斷試紙的檢測(cè)線（T線）和控制線（C線）包被于硝酸纖維素膜(NC膜)上，組裝成試紙條。確定了免疫膠體金的稀釋度為1:2，T線包被濃度為2mg/ml，C線包被濃度為4mg/ml。
　　 使用研制的MPS試紙條和ELISA方法分別對(duì)54份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示ELISA法檢測(cè)陽性率為90.7％，MPS診斷試紙檢測(cè)陽性率為83.8％。用MPS試紙條檢測(cè)與ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)