診斷家畜日本血吸蟲病膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。家畜血吸蟲病診斷技術(shù)主要為病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷。但隨著感染強度的不斷下降，傳統(tǒng)的診斷方法越來越不適用于現(xiàn)場應(yīng)用。為適應(yīng)基層血吸蟲病篩查和普查的需要，有必要研制針對多種動物的快速檢測試劑盒。膠體金免疫層析技術(shù)因其具有簡便、快速、敏感、特異、無需特殊儀器等優(yōu)點而適于疫區(qū)現(xiàn)場大規(guī)模篩查。本課題目的是研制一種敏感性高、特異性強能夠檢測多種動物日本血吸蟲病的試紙條。
　　根據(jù)鏈球菌蛋白G（SPG）

2、具有與多種動物的IgG結(jié)合特性，對鏈球菌蛋白G進行生物學(xué)分析，設(shè)計重組蛋白G（rSPG）的基因序列，構(gòu)建rSPG的2種原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)，得到帶有GST和His標(biāo)簽的融合蛋白，通過親和層析純化蛋白。Western blotting的結(jié)果顯示，兩種rSPG均有與IgG結(jié)合的能力。ELISA測定2種帶有不同標(biāo)簽的rSPG與牛、山羊、兔、鼠四個物種IgG的親和力，顯示帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白G的親和力普遍高于商品化鏈球菌蛋白G，

3、帶有His標(biāo)簽的重組蛋白G的親和力與商品化鏈球菌蛋白G相比基本一致。
　　將兩種重組蛋白G進行膠體金標(biāo)記蛋白的最佳pH值、最佳標(biāo)記量的確定，最后選用His-rSPG進行膠體金的標(biāo)記及制備金標(biāo)墊。分別用可溶性蟲卵抗原（SEA）和His-rSPG作為檢測線和質(zhì)控線，確定其最佳劃線濃度與血清最佳稀釋度。結(jié)果表明，膠體金標(biāo)記蛋白的最佳pH值為5.0、最佳標(biāo)記量為10μg/ml；檢測線和質(zhì)控線的最佳劃線濃度均為0.5 mg/mL；血清最佳稀

4、釋度為1:20。
　　用組裝好的試紙條檢測標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性BALB/c鼠與新西蘭大白兔血清，以及糞檢陰、陽性的山羊血清、水牛血清，評估其敏感性和特異性；用膠體金免疫層析試紙條法（GICA法）檢測前后盤吸蟲病牛血清、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病羊血清、東畢吸蟲病羊血清，并與ELISA法相比較，評價其交叉反應(yīng)性。為進一步對試紙條進行評價，分別用GICA法和ELISA法分別對不同感染強度的水牛血清進行檢測。對于血紙的評價，用實驗室人工感染的水牛陰、陽性血

5、紙和從疫區(qū)采集的水牛血紙分別用GICA法和ELISA法進行檢測，評估檢測效果。
　　結(jié)果表明，以重組蛋白G制備的試紙條可用于檢測日本血吸蟲感染BALB/c鼠、新西蘭大白兔、水牛、山羊血清抗體。該試紙條檢測日本血吸蟲感染小鼠與兔血清的敏感性、特異型均為100.00％。檢測山羊血清的敏感性為100.00%，與ELISA法相同；特異性為88.64%，高于ELISA法的75.00%。檢測水牛血清的敏感性為100.00%，與ELISA法相同

6、；特異性為94.23%，高于ELISA法的84.62%。其與前后盤吸蟲交叉反應(yīng)率為14.29%；與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲交叉反應(yīng)性為16.67%；與東畢吸蟲的交叉反應(yīng)性為33.33%。在對不同感染強度的水牛血清進行評估時，GICA法和ELISA法檢測日本血吸蟲感染的水牛血清其特異性均為100.00%。在感染強度<20條/頭時，GICA法的敏感性為75.00%低于ELISA法的100.00%。在感染強度>20條/頭時，GICA法和ELISA法的敏感