低溫誘導(dǎo)煙草早花研究與煙草MADS-box基因的同源克隆.pdf

1、煙草是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物,在煙葉種植過程中易出現(xiàn)早花現(xiàn)象,煙草早花嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)昔。低溫是誘導(dǎo)煙草早花的重要因素之一,到目前為止,其相關(guān)的早花規(guī)律研究結(jié)果意見不一,其分子機(jī)制也一直不清楚。本研究利用低溫敏感的烤煙品種NC82,通過不同苗期的低溫誘導(dǎo)處理(12℃10 d),研究該品種在不同苗期對低溫的敏感特性；與此同時(shí),采用RT-PCR.和RACE等同源克隆技術(shù)對NC82中與開花相關(guān)的MADS-box家族基因進(jìn)行同源克隆,并采用

2、半定量RT-PCR和Real-Time PCR技術(shù)對克隆得到的基因進(jìn)行表達(dá)分析。該研究具有現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)指導(dǎo)意義,也為培育低溫不敏感烤煙品種提供很好的功能基因。具體研究結(jié)果如下:
　　 (1)NC82的低溫誘導(dǎo)結(jié)果:移栽后第16 d,8葉期低溫處理的煙苗首先出現(xiàn)花芽分化跡象,開始由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變；移栽后第21 d,6葉期和8葉期低溫處理的煙苗均出現(xiàn)花芽分化,其對照均在移栽后第26 d左右才出現(xiàn)花芽分化,低溫處理分別使其花芽分

3、化提前5 d和8 d；移栽后第31d,6葉期和8葉期低溫處理的煙卣提前現(xiàn)蕾,其對照在移栽第36 d左右才現(xiàn)蕾；低溫處理和對照煙苗的中心花開放時(shí)間相差2～3 d。均在移栽后的第45～49 d；4葉期低溫處理的煙苗則相反,其花芽分化、現(xiàn)蕾和中心花開放分別比對照晚11d、18 d和16 d。所以6葉期和8葉期是NC82低溫敏感期,低溫能促進(jìn)早花,但4葉期易受低溫傷害,延遲開花；低溫處理煙苗的花芽分化到現(xiàn)蕾時(shí)間比對照時(shí)間長,說明低溫延長了花原基

4、的分化過程；而現(xiàn)蕾到開花的天數(shù)波動(dòng)很大,可能受環(huán)境影響很大。
　　 (2)煙草MADS-box基因家族中間片段克隆:通過設(shè)計(jì)簡并引物,采用RT-PCR技術(shù)從NC82莖尖中成功分離出27條cDNA片段,長度在122～146 bp之間。序列分析表明,其中有16條具有MADS MEF2類保守結(jié)構(gòu)域,與擬南芥等MADS-box基因家族成員具有很高的同源性,相似性平均能達(dá)到76％,并具有15個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn),其中7個(gè)位點(diǎn)參與蛋白與DNA

5、的相互作用,5個(gè)位點(diǎn)具有蛋白二聚化功能。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)這16條保守片段分別和擬南芥9個(gè)不同的MADS-box基因家族亞類最近似,其中FLC、STMADS11、TM3和AGL6亞家族具有控制開花時(shí)間的功能；AG、4GL2和DEF／GLO亞家族分別屬于C／D型、E型和B型花器官同源異型基因；AGL15和AGL12亞家族的基因在莖中也可以表達(dá)。
　　 (3)煙草NtFLC的全長克隆及表達(dá)分析:利用與擬南芥AtFLC相似性最高的中間片

6、段LyE05設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3’RACE和5’全長克隆,選取5’完整的片段A5(805 bp)和B1(433 bp),3’RACE的845 bp全長,以及中間保守序列LyE05(146 bp)進(jìn)行煙草FLC類基因的全長拼接,得到1174 bp的煙草FLC類全長cDNA。應(yīng)用NCBI的ORF finder軟件,發(fā)現(xiàn)其可讀框架(ORF)位于172～786位核酸之間,長度615 bp,編碼204個(gè)氨基酸,該蛋白屬于MADS-box基因家族,并含有