太行花MADS-box基因克隆、表達(dá)模式及功能分析.pdf

1、基因的重復(fù)(duplication)及其功能的多樣性(diversification)為生物體新的形態(tài)進(jìn)化提供了原材料。重復(fù)的基因通過表達(dá)方式和(或)編碼序列的改變而導(dǎo)致其亞功能化(subfunctionalization)和(或)新功能化(neofunctionalization)，從而使這些重復(fù)基因有可能保留在生物體中，增添生物的遺傳穩(wěn)定性(robustness)和多樣性。MADS-box基因在植物(特別是在被子植物)的進(jìn)化過程中發(fā)

2、生了大量的基因重復(fù)事件而形成一個(gè)多基因家族。MADS-box基因家族的不同成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著非常重要的作用，在調(diào)控開花時(shí)間、決定花分生組織和花器官特征，以及調(diào)控根、葉、胚珠及果實(shí)的發(fā)育中起著廣泛的作用。開展對(duì)MADS-box基因家族成員的序列結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及編碼蛋白的功能研究可以為這些同源基因在生物體中的可能命運(yùn)提供很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究以我國(guó)特有的薔薇科物種太行花做實(shí)驗(yàn)材料，通過3’RACE和5’RACE方法從太行花中克隆了

3、7個(gè)MADS-box家族的基因。序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明這7個(gè)基因分別與擬南芥的MADS-box基因AG、SHP(SHP1/2)、PI、AP1、FUL和SEP1以及與矮牽牛MADS-box基因PhTM6具有很高的同源性并聚為一支，從而將這7個(gè)MADS-box基因分別命名為TrAG(Taihangia rupestris(AG))、TrSHP((T)aihangiarupestris(SHP))、TrPI((T)aihangia(r)up

4、estris(PI))、TrAP1((T)aihangiarupestris(AP1))、TrFUL((T)aihangia rupestris(FUL))、TrSEP1((T)aihangia(r)upestris(SEP1))和TrTM6((T)aihangia rupestris Ph(TM6))。針對(duì)克隆的這些基因，具體進(jìn)行了以下幾方面的研究：
　　 第一，對(duì)TrAG和TrSHP兩個(gè)MADS-box基因進(jìn)行了研究，它們分

5、別屬于AG亞家族中旁系同源進(jìn)化系euAG和PLE進(jìn)化系的成員。通過原位雜交的方法分析了旁系同源基因TrAG和TrSHP的表達(dá)方式是否發(fā)生了分化；構(gòu)建組成型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，分析了TrAG和TrSHP的編碼蛋白的功能是否發(fā)生了改變；并進(jìn)一步通過酵母雙雜交的方法比較了TrAG和TrSHP的相互作用方式是否發(fā)生了分化。原位雜交分析表明，TrAG和TrSHP主要在雄蕊、心皮和胚珠中表達(dá)。在花發(fā)育過程中，TrAG起始表達(dá)比TrSHP早，在

6、隨后將形成雄蕊和心皮原基的分生組織區(qū)域以及雄蕊原基中表達(dá)；然而直到雄蕊原基出現(xiàn)前未檢測(cè)到TrSHP的表達(dá)。在雄蕊原基形成之后，TrAG和TrSHP在發(fā)育的雄蕊、隨后將產(chǎn)生心皮原基的分生組織區(qū)域以及心皮原基中表達(dá)。在花發(fā)育的晚期，TrAG在發(fā)育的柱頭、花柱以及胚珠中均有表達(dá)，而TrSHP僅在胚珠中表達(dá)。35S∷TrAG和35S∷TrSHP轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出相似的表型，包括開花提前；蓮座葉和莖生葉向腹卷曲、變小；花芽在時(shí)期13前即開放，

7、萼片包裹不住花芽；萼片和花瓣分別被同源異型轉(zhuǎn)化為心皮化和雄蕊化器官，并在萼片向腹面產(chǎn)生異位的胚珠；在莖生葉上產(chǎn)生柱頭化的乳突和胚珠；子房彎曲；果實(shí)提前沿著開裂區(qū)裂開，暴露出胚珠。此外，也觀察到35S∷TrAG和35S∷TrSHP轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的一些表型差異，35S∷TrAG轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花芽呈暗綠色，而35S∷TrSHP轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花芽呈黃綠色；不同與35S∷TrAG轉(zhuǎn)基因植株表型的是，35S∷TrSHP轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花被脫落

8、受到了抑制，偶爾可以觀察到花絲基部融合，果實(shí)變短、育性降低。酵母雙雜交分析表明TrAG可以與TrSEP3相互作用，而TrSHP不能與TrSEP3形成異源二聚體。以上研究結(jié)果表明做為旁系同源基因，TrAG和TrSHP在表達(dá)方式上發(fā)生了改變，在蛋白編碼序列上保持了其祖先的功能，但是編碼序列的一些差異還是導(dǎo)致它們之間生化作用方式的不同和一定程度上的亞功能化?；谝陨涎芯拷Y(jié)果并結(jié)合先前報(bào)道的在擬南芥、金魚草和矮牽牛等物種中旁系同源基因的表達(dá)和功

9、能數(shù)據(jù)，我們提出在不同物種中旁系同源基因在進(jìn)化過程中維持部分功能冗余(redundant)，但是也通過改變表達(dá)方式、編碼蛋白的功能及蛋白相互作用方式呈現(xiàn)出不同形式的亞功能化和(或)新功能化。
　　 第二，對(duì)TrPI基因的功能也進(jìn)行了初步研究，它屬于AP3/PI亞家族PI-like進(jìn)化系的成員。原位雜交結(jié)果表明，TrPI主要在花瓣、雄蕊和胚珠中表達(dá)。顯示出TrPI與擬南芥同源基因PI保守的表達(dá)模式。35S∷TrPI轉(zhuǎn)基因擬南芥植株

10、蓮座葉發(fā)生延遲、變小、并且第一至第三片蓮座葉呈白色針狀；蓮座葉和莖生葉并不像野生型呈有規(guī)則的螺旋狀排列；花序莖基部、中間或頂端發(fā)生2-3個(gè)分支；在莖生葉的葉腋內(nèi)的花序抽出時(shí)間明顯晚于野生型，并且很小甚至不能完全抽出而藏在葉腋內(nèi)。低溫條件下轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉的表型更加明顯，表現(xiàn)為蓮座葉變?yōu)獒槧睿瑹o葉片，僅有葉柄結(jié)構(gòu)。這明顯不同于35S∷PI轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型。此外，酵母雙雜交分析表明TrPI自身可以形成同源二聚體。這種相互作用方式也不同

11、與擬南芥中PI的相互作用方式。以上研究結(jié)果表明，TrPI可能與擬南芥PI具有保守的表達(dá)模式但編碼的蛋白可能獲得了新的功能。
　　 第三，構(gòu)建了一個(gè)AP1-like基因(TrAP1)的過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株，通過反向遺傳學(xué)分析了TrAP1的功能。35S∷TrAP1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株開花提前；花序以兩朵花終止，形成terminal flower的表型；偶爾可以觀察到雄蕊轉(zhuǎn)化為花瓣化的器官；蓮座葉呈黃綠色并且其邊緣呈鋸齒狀。