中國櫻桃花芽休眠相關MADs-box轉錄因子克隆與功能分析.pdf

1、中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）屬薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬（Prunus），是我國重要的栽培果樹之一。其果實具有璀璨晶瑩、形嬌味美、營養(yǎng)豐富等特點，深受消費者喜愛。中國櫻桃與其它落葉果樹一樣，都有典型自然休眠現(xiàn)象。休眠是果樹渡過溫帶嚴寒的一種方式，若花芽不能正常解除休眠，則會出現(xiàn)開花不整齊、坐果率低等問題，直接影響果實的品質和產(chǎn)量。落葉果樹休眠是十分復雜的過程，目前認為足夠的低溫積

2、累是誘導中國櫻桃花芽休眠解除的關鍵因素之一。但由于缺少中國櫻桃基因組信息，花芽休眠的分子機制仍不清楚。因此本研究利用RNA-Seq技術構建了中國櫻桃優(yōu)良品種‘短柄櫻桃’（Prunuspseudocerasus cv.‘Duanbing’）花芽轉錄組均一化文庫和不同休眠狀態(tài)花芽的數(shù)字基因表達譜(Digital Gene Expression Profiling，DGE)，并篩選了差異表達基因(Differentially Expresse

3、d Genes，DEGs)，分析了該轉錄組中具有全長序列的MADS-box轉錄因子編碼基因，克隆了3個與櫻桃花芽休眠相關的MADS基因(Dormancy associated MADS-box，DAM)，為進一步揭示低溫誘導中國櫻桃花芽休眠解除的分子生物學機制奠定了基礎。
　　主要結果如下:
　　(1)通過對櫻桃休眠花芽均一化轉錄組文庫測序，獲得了Clean reads47，599，914個，最終拼接獲得平均序列長度為837

4、bp的Unigene序列50，604條，GO功能分類結果分析發(fā)現(xiàn)有16，186個Unigene被分別注釋到生物學過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫，將21，143個Unigenes序列被分別注釋到128個代謝通路。其中比例最高的是代謝途徑(KO01100:5077 Unigenes，24.01％)，其次是次生

5、代謝物合成途徑(KO01110:2518 Unigenes，11.91％)，植物病原交互途徑(KO04626:1381 Unigenes，6.53％)以及植物激素信號轉導途徑(KO04075:1048 Unigenes，4.96％)。
　　(2)利用RNA-seq技術構建了深度休眠期、50％休眠解除期和100％休眠解除期的櫻桃花芽(FB0、FB365、FB724) DGE。通過兩兩文庫比對，分析發(fā)現(xiàn)三個文庫得到總clean rea

6、ds都高于6M，其中FB0-VS-FB365有259個上調和1385個下調DEGs; FB0-VS-FB724有1103個上調和1853個下調DEGs; FB365-VS-FB724有940個上調和513個下調DEGs。通過GO功能分析顯示(P≤0.05)，在FB0-VS-FB365中富集的10個GO條目，其中最顯著的是光合膜(photosyntheticmembrane)，F(xiàn)B365-VS-FB724中富集的有1個GO條目，為細胞外區(qū)

7、域(extracellular region)，在FB0-VS-FB724中富集的有4個GO條目。Pathway分析表明(Q≤0.05)，F(xiàn)B0-VS-FB365、FB365-VS-FB724和FB0-VS-FB724中分別有889、909和1712個DEGs各被注釋到111、111和120的KEGG代謝通路，涉及多種代謝途徑。在FB0-VS-FB365、FB365-VS-FB724、FB0-VS-FB724中分別有572(64.3％)

8、、771(84.8％)、1385(80.9％)個DEGs被分別注釋到13、16、17個代謝通路。隨機挑選DEGs的Q-PCR數(shù)據(jù)與RNA-Seq的數(shù)據(jù)變化趨勢基本一致，呈極顯著水平，說明基于RNA-Seq分析的基因表達譜數(shù)據(jù)結果具有較高可信性的。
　　(3)從櫻桃花芽轉錄組分析中，獲得18個具有全長開放閱讀框的MADS-box轉錄因子(PpcMADS)，對它們編碼的氨基酸基本性質和結構進行了系統(tǒng)分析結果表明，除KP347550和K

9、P347552以外，均屬于MIKC家族，大部分為不穩(wěn)定堿性親水蛋白，二級結構中同時含有α-螺旋、β-轉角、擴展鏈和無規(guī)則卷曲結構，其中α-螺旋所占比例最高。亞細胞定位分析顯示，MADS-box蛋白主要定位在細胞核中，而KP347549、KP347545和KP347552分別定位到細胞質和質膜的幾率較高。序列主要含有四個保守基序，其中基序1為該基因家族的保守基序，含有MADS盒。PpcMADS轉錄因子可以分為AP3亞組、PI亞組、SHP亞

10、組、AG亞組、AP1亞組、SEP亞組、SOC亞組、SVP亞組及4個未知亞組。KM243368、KM243373、KM243375、KP347546、KP347547、KP347551和KP347552只在花中表達，KM243377和KP347550在花和果實中均不表達，其他9個基因在兩個組織中都表達。
　　(4)進一步使用RACE技術克隆了3個與花芽休眠相關MADS轉錄因子(PpcDAM)，聚類分析結果表明，這3個基因分別與桃、梅

11、的休眠相關MADS轉錄因子DAM4、DAM5和DAM6單獨聚成一支，且與李屬植物的MADS-box基因關系最近，分別將三個基因命名為PpcDAM4、PpcDAM5和PpcDAM6，其基因表達與休眠解除過程具有相似趨勢。隨著內休眠的解除，呈下調表達，在生態(tài)休眠期維持較低水平，推測認為這3個基因可能對花芽休眠具有調控作用。為進一步分析基因表達模式，克隆了PpcDAM4基因啟動子，對該啟動子序列進行預測分析，發(fā)現(xiàn)該序列中除含有高等植物基因啟動

12、子特征功能元件，還含有CRT/DRE識別位點，通過雙熒光素酶瞬時表達，發(fā)現(xiàn)C-repeat binding transcriptionfactor(CBF)對該啟動子具有促進調控作用，認為低溫響應可能是通過CBF途徑介導的。另外，將PpcDAM6基因遺傳轉化擬南芥，通過種子萌發(fā)試驗，發(fā)現(xiàn)轉基因種子明顯受到抑制，說明該基因在櫻桃花芽中被低溫誘導表達，對花芽的萌發(fā)具有抑制作用。根據(jù)以上研究結果，我們認為PpcDAM基因可能參與了中國櫻桃花芽