白菜花粉異基因BcSKSII在花粉發(fā)育授受精中的表達分析及功能鑒定.pdf

1、花粉發(fā)育與授粉受精是一個多基因調(diào)控的復雜過程。研究表明,花粉發(fā)育基因特別是一些細胞壁相關基因持續(xù)表達并特異地調(diào)控后續(xù)的授粉受精相關過程。近年來,以擬南芥、水稻為代表的植物花粉轉(zhuǎn)錄組的大規(guī)模分析結(jié)果表明,成熟花粉中具有后續(xù)花粉萌發(fā)和花粉管生長過程所需的mRNA。這些存儲的mRNA怎樣以完整長度的形式存在并安全的度過花粉成熟和水合階段,以及如何傳遞到其發(fā)揮作用的組織,仍然沒有一個確切的答案。本實驗室采用ATH1芯片分析了白菜(Brassic

2、a campestrisL.ssp.chinensis Markino var.communis Tsen et Lee)授粉受精前后雌蕊基因的表達差異,檢測到一批花粉發(fā)育和授粉受精過程特異表達的細胞壁相關基因,它們在授粉后的雌蕊中上調(diào)表達,同時在白菜mmc對應的野生型中上調(diào)表達(蔣晶晶等,未發(fā)表)。其中,轉(zhuǎn)錄本標識為At3g13390的基因可能編碼的蛋白質(zhì)是一個多銅氧化酶并可能作用于花粉發(fā)育及授粉受精過程。在植物中,常見的多銅氧化酶包

3、括抗壞血酸氧化酶、漆酶2種類型,它們對于植物的生長發(fā)育特別是植物組織器官的生長具有重要的作用,但對于其功能的研究相對較少。為了研究該基因的結(jié)構(gòu)和表達特征,為進一步確定其功能打下基礎,本研究利用cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術和同源擴增的方法克隆基因全長,分析其序列特征并預測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,進而采用RT-PCR方法分析其在可育株系和不育株系中不同發(fā)育階段的花蕾中和營

4、養(yǎng)器官的表達情況,采用組織原位雜交進行該基因的細胞定位,分析其與花粉發(fā)育的關系;同時,利用擬南芥T-DNA插入突變體,比較突變體植株和野生型植株在形態(tài)、育性、花器結(jié)構(gòu)、花粉形態(tài)及萌發(fā)能力等方面的差異,為闡明該基因的生物學功能提供實驗證據(jù),也為研究mRNA的儲存與轉(zhuǎn)運提供一定的研究基礎。取得的主要成果如下:
　　 (1)在研究白菜核隱形雄性不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’花蕾的基因表達差異時,檢測到一批花粉發(fā)育和授粉受精過

5、程特異表達的細胞壁相關基因,發(fā)現(xiàn)了一個推定的多銅氧化酶基因,利用同源擴增、兼并引物PCR技術及3'RACE相結(jié)合的方法擴增得到了其eDNA和DNA全長。該基因DNA全長共1911 bp,ORF全長為1668 bp,包含兩段內(nèi)含子,且連接處均符合GT-AG規(guī)律。該基因編碼555個氨基酸,其二級結(jié)構(gòu)含有7.21％的α螺旋,35.68％的p折疊和57.12％的環(huán)狀結(jié)構(gòu);并包含1個疏水信號肽、5個高親水性區(qū)域以及6個N-糖基化位點、1個葡聚糖依

6、附位點、11個蛋白激酶C磷酸化位點、4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、9個N端肉豆蔻酰化位點和1個ATP/GTP連接位點模序A等生物學位點。其三維結(jié)構(gòu)是由一系列l(wèi)oop環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接的β-片層和α-螺旋組成的一個復雜結(jié)構(gòu)體。通過SMART數(shù)據(jù)庫分析推定該蛋白存在抗壞血酸氧化酶典型的三個結(jié)構(gòu)域:Cu-oxidase3、Cu-oxidase、Cu-oxidase2,說明這是一個典型的抗壞血酸氧化酶基因。但與其他抗壞血酸氧化酶不同的是,它缺少部分銅離

7、子連接所必需的組氨酸位點。而擬南芥中SKS基因家族、煙草NTP303基因家族成員氨基酸序列也具有相同的特征。該基因又與擬南芥SKS11序列最接近,命名為BcSKS11。此外,該基因還可能編碼一個糖基化錨定蛋白。
　　 (2)為了確定BcSKS11的時空表達特點,我們利用RT-PCR技術檢測了它在白菜'Bcajh97-01A/B'不育株系和可育株系5級花蕾,不育株授粉1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h后的嫩角果,可育株

8、系開放花序、角果、根、莖、葉片,可育株系即將開放的花蕾的花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、蜜腺中的表達情況。對其在可育系花序、角果、莖、葉、根中的表達結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)BcSKS11只在花序中表達;對不育系和可育系5級花蕾進行表達分析,結(jié)果表明該基因最先表達于第4級花蕾中,即雙核期;在成熟花粉中表達量最高。進而選取第4和第5級成熟花蕾的花瓣、萼片、雌蕊、雄蕊、蜜腺等組織進行RT-PCR分析,BcSKS11只在雄蕊中有較高的表達,而花蕾其他部分均未發(fā)現(xiàn)

9、該基因的表達。在授粉后的嫩角果中,BcSKS11仍持續(xù)表達,隨著授粉后生長時間的增加,表達也隨之增加,在授粉8-12 h表達量最高,隨后又下降。應用組織原位雜交方法對BcSKS11進行定位,該基因在特異表達于第5級花蕾的花粉中。
　　 (3)將擬南芥突變體采用“三引物法”篩選出純合突變體,然后,對它們及其野生型植株的生長狀況與形態(tài)進行觀察,并進行相關基因表達分析。擬南芥T-DNA插入突變體植株sks11-1、sks11-2營養(yǎng)生

10、長、花、嫩角果、種子、花藥結(jié)構(gòu)、花粉核形狀均正常,并且可以正常開花、結(jié)果,與野生型相比均沒有明顯差異。花粉離體萌發(fā)觀察時發(fā)現(xiàn)萌發(fā)5 h以后,擬南芥突變體及野生型花粉均能正常萌發(fā),花粉管生長長度基本一致。但是將sks11-1與野生型花粉分別授到野生型植株的雌蕊組織中1 h以后,突變體花粉在體內(nèi)萌發(fā)數(shù)量明顯減少,說明SKS11可能對花粉管的體內(nèi)生長有影響。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),T-DNA插入導致SKS11 mRNA表達量下降,同時引起了