白菜花粉發(fā)育相關的C2H2型鋅指蛋白新基因BcMF20的克隆與功能驗證.pdf

1、選育雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢利用中簡化制種程序、降低制種成本的重要手段，而十字花科作物生產一代雜種的理想系統(tǒng)是雄性不育系，花粉敗育是植物雄性不育發(fā)生的表型體現(xiàn)，弄清花粉發(fā)育的分子機理是研究雄性不育的關鍵所在。本實驗室在成功構建了三種共享同一保持系(核不育兩用系的可育株系)的白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis)‘矮腳黃’核不育(‘Ai

2、jiaohuang’genic male sterility，ajhGMS)兩用系‘Bcajh97-01A/B’、‘Polima’核質互作不育(polima genic-cytoplasmic male sterility，polG-CMS)系‘Bcpol97-05A’以及‘Ogura’細胞質不育(Ogura cytoplasmic male sterility，oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料體系的基礎上，采用擬南芥基因

3、芯片分析其花蕾轉錄組差異，對花粉基因表達譜進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)在三種不育系花蕾中均下調表達的基因有29個，在這29條基因中，大部分(14條)是功能未知基因，僅有2條是轉錄因子。其中一條的轉錄本標簽是At1＃6610，這是一條C2H2鋅指家族的轉錄因子。At1＃6610在三種不同雄性不育遺傳模式的材料中表達均下調，提示我們它可能與花粉發(fā)育相關。本研究通過同源克隆的方法獲得白菜中At1g26610的同源基因的編碼序列和DNA全長，分析其序列特

4、征；克隆其在十字花科蕓薹屬和蘿卜屬的18份材料中的同源基因，同時通過與近緣基因的比較，構建分子進化樹，探討進化關系；運用半定量PCR和實時定量熒光PCR技術分析該基因在‘Bcajh97-01A/B’不育株和可育株花蕾五級、花序、嫩角果、花莖和花葉中的表達情況，同時采用原位雜交方法分析其在組織中的定位，明確其時空表達情況；最后運用反義RNA技術，對擬南芥進行轉化，獲得這個基因的功能缺失突變體，鑒別該基因在花粉發(fā)育過程中的作用。取得的主要結

5、果如下：
　　 (1)依據擬南芥At1g26610序列，采用同源克隆方法擴增獲得在可育株‘Bcajh97-01B’中高表達的轉錄本標簽At1g26610在白菜中的同源基因，對該基因的cDNA序列和DNA序列分析可知，該基因最大開放閱讀框為1359 bp，無內含子和外顯子，Blast搜索沒有發(fā)現(xiàn)相同序列的基因，說明這是一條新基因，我們將其命名為BcMF20(Brassica campestris male fertility ge

6、ne20)。對推導的BcMF20編碼氨基酸序列進行結構和功能域的分析表明，BcMF20編碼452個氨基酸。編碼的假定蛋白質的分子量為50.874 kDa，等電點為8.562，pH7.0時的電荷為12.241，包含堿性氨基酸(K，R)72個，酸性氨基酸(D，E)63個，疏水氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V)105個，極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)133個。BcMF20基因是MMB型的3鋅指C2H2鋅指家族轉錄因子，其結構與矮牽牛EPF

7、家族的TAZ1(ZPT3-2)基因的相似程度較高。
　　 (2)根據BcMF20的全長序列設計引物，在十字花科蕓薹屬和蘿卜屬的18個物種中克隆到BcMF20的同源序列，對十字花科植物BcMF20同源基因DNA序列進行核苷酸同源序列比對，發(fā)現(xiàn)BcMF20同源基因在DNA序列上的相似性為86.9％～100％。所有基因均沒有內含子，尤其是在CDS的起始區(qū)和終止區(qū)，序列完全相同。它們所編碼的蛋白質同源性高達77.6％～100％，均是3個

8、鋅指的C2H2轉錄因子，且編碼的鋅指類型與BcMF20一致，均為MMB型。在鋅指的保守區(qū)域，堿基序列完全相同。在NCBI上對BcMF20.進行BLAST搜索查詢，發(fā)現(xiàn)12個與BcMF20有較高相似性的C2H2鋅指轉錄因子，NJ法構建系統(tǒng)樹，結果顯示BcMF20與同科的擬南芥的三條C2H2鋅指轉錄因子聚成一類，然后再與矮牽牛中的兩條C2H2的4鋅指C2H2轉錄因子聚為一類。
　　 (3)采用半定量PCR和實時定量PCR技術分析Bc

9、MF20在‘Bcajh97-01A/B’不育株和可育株花蕾五級、花序、嫩角果、花莖和花葉中的表達情況，半定量PCR結果顯示BcMF20基因僅在可育系Ⅳ級、Ⅴ級花蕾中有表達，說明BcMF20基因可能與花粉發(fā)育相關；實時定量PCR結果表明BcMF20在不育系‘Bajh97-01A’中的表達量極低，BcMF20基因在花蕾Ⅰ級-Ⅴ級以及開放的花中表達，在角果、花莖、花葉中無表達，并且BcMF20基因在可育系Ⅳ級、Ⅴ級花蕾中表達量非常大，實時定量

10、PCR的結果證明該基因確實與花粉發(fā)育有關，按照Mascarenhas(1990)對花粉表達基因的分類方法，應該被歸于“晚期”基因。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)雜交信號出現(xiàn)在單核小孢子時期的小孢子和絨氈層細胞中，在花粉成熟早期的小孢子和將要降解的絨氈層細胞中繼續(xù)表達，提示我們BcMF20可能在單核小孢子時期對絨氈層和花粉發(fā)育起作用。
　　 (4)構建含有組成型啟動子CaMV35S的RNA反義載體，并利用Floral Dip法將構建的反義載體導

11、入擬南芥中，與空載體對照比較，轉基因植株營養(yǎng)生長正常，雌蕊正常，花藥上花粉量少，最終不能形成正常飽滿果莢。轉基因擬南芥花粉不萌發(fā)，T1代萌發(fā)率為13％，T2代為15％。掃描電鏡顯示，82％的轉基因植株的花粉畸形。與正常的橢圓形、三條萌發(fā)溝均勻分布的花粉粒相比，轉基因植株的花粉呈現(xiàn)各種空洞，凹陷，異?？瞻T。透射電鏡顯示導致轉基因植株花粉萌發(fā)率降低的主要原因有兩個：一是花藥內花粉數量減少，二是花粉畸形、空泡化。轉基因植株的花粉畸形是由于花粉