白菜組蛋白賴氨酸甲基化相關SDG家族的演化與在花粉發(fā)育中的作用分析.pdf

1、花粉發(fā)育是植物有性生殖的關鍵環(huán)節(jié)，涉及有絲分裂、減數(shù)分裂等截然不同的細胞學過程以及絨氈層降解、花粉壁形成等獨一無二的生物學過程，同時也與農業(yè)生產上的雄性不育、作物產量、種子品質等問題密切相關，對該過程的研究兼具理論與實踐意義。組蛋白賴氨酸甲基化共價修飾通過對花粉發(fā)育相關基因的選擇性轉錄參與這一過程。在植物中，SET domain group(SDG)家族是唯一具有組蛋白賴氨酸甲基轉移酶活性的蛋白家族，其在多個物種中的成員組成業(yè)已明確，對

2、亞家族的分類方式也已達成共識。但是目前對SDG家族的演化過程缺乏系統(tǒng)性研究，對四個主要亞家族之間的相對演化關系也并不明確。此外，數(shù)個SDG基因已被證實在擬南芥中表達的異常會引起花粉敗育，而對擬南芥不同發(fā)育時期花粉芯片表達數(shù)據(jù)的梳理表明應有更多的SDG基因參與了這一過程。本研究基于已公布的基因組數(shù)據(jù)，對白菜SDG家族的成員進行篩選查找、序列分析，并通過與擬南芥直系同源基因的比較，探討了白菜SDG家族的演化過程以及四個主要亞家族基因的演化模

3、式及起源。隨后，對H3K4me3和H3K27me3兩種與基因表達密切相關的共價修飾在白菜花粉發(fā)育中的變化進行了跟蹤檢測，并從白菜花蕾轉錄組數(shù)據(jù)中篩選得到了一系列可能與花粉發(fā)育相關的候選SDG基因。最后，分析了一個在白菜雄性不育株系花序中特異高表達的SDG基因(ASHR1)的表達模式，并分別以白菜和擬南芥為材料對該基因的功能進行了鑒定。主要研究結果如下:
　　(1)通過對白菜基因組數(shù)據(jù)庫的分析，篩選得到白菜SDG基因67個，并根據(jù)它

4、們與擬南芥基因的共線性關系，找到2個額外的擬南芥SDG基因。白菜SDG基因分布在10條染色體上，與擬南芥直系同源基因具有良好的共線性關系;它們分屬于7個亞家族，各亞家族之間在基因長度、基因結構和編碼蛋白的結構域上具有明顯差異;相比于其他物種，白菜SDG基因數(shù)目多，占基因組比例大;大量旁系同源基因對在表達模式和亞細胞定位上具有顯著差異。
　　(2)通過與擬南芥直系同源基因的比較，發(fā)現(xiàn)白菜SDG家族中E(z)、Ash、Trx和Suv四

5、個主要亞家族的成員與擬南芥直系同源基因具有較大差異。其中逾半數(shù)基因的基因結構與擬南芥直系同源基因存在差異，這些差異涉及內含子的增加、丟失，外顯子的增加、丟失以及內含子相位的移動。結合其他物種直系同源基因的序列分析，表明這些差異基本產生自白菜。蛋白結構域架構分析同樣表明大量白菜SDG蛋白有別于擬南芥直系同源蛋白，且部分結構域或結構域的架構方式在所研究的其他物種中都不存在，而僅存在于白菜。農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達和基因槍介導的洋蔥表皮細

6、胞瞬時表達實驗證實白菜和擬南芥中4對直系同源SDG蛋白具有不同的亞細胞定位。利用PhylogeneticAnalysis by Maximum Likelihood(PAML)軟件進行的分子演化速率分析表明近1/3的白菜SDG基因具有較快的分子演化速率。
　　(3)通過對SET結構域內含子相位的分析，明確了SDG家族四個主要亞家族的演化模式。E(z)亞家族起源于1個祖先基因，Ash亞家族起源于3個祖先基因，Trx亞家族起源于2個祖

7、先基因，Suv亞家族起源于3個祖先基因。對四個主要亞家族基因在基因結構、結構域架構、亞細胞定位和分子演化速率上差別的綜合分析表明，各亞家族之間在演化速率上具有明顯差異。其中Trx亞家族演化速率最快，SUVR亞族次之，E(z)亞家族再次之，而SUVH亞族和Ash亞家族演化速率最慢。
　　(4)利用免疫熒光分析確定了H3K4me3和H3K27me3兩種共價修飾在白菜花粉發(fā)育中的變化模式。H3K4me3存在于花粉母細胞、單核小孢子的細胞

8、核以及雙核花粉的營養(yǎng)核和三核花粉的營養(yǎng)核和精細胞。H3K27me3除同樣存在于上述時期花粉的細胞核外，還存在于雙核花粉的精核中。兩種共價修飾都不存在于四分體時期的花粉。
　　(5)對白菜從花粉母細胞時期到成熟花粉期5個不同發(fā)育級別花蕾轉錄組測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，44個白菜SDG基因在花蕾各發(fā)育階段表達，除一個基因外，其余基因根據(jù)其表達模式可以分為5個類群，分別對應于花粉發(fā)育的5個時期。其中70％的基因在花蕾發(fā)育的不同階段差異表達，4

9、1％的基因在可育株系和不育株系各級花蕾中差異表達。通過與擬南芥芯片數(shù)據(jù)的綜合比較，篩選得到7個極有可能作用于花粉發(fā)育的候選SDG基因，包括2個已證實作用于該過程的基因。
　　(6)利用定量PCR技術研究表明，實驗室早期利用擬南芥芯片篩選得到的在不育株系中高表達的SDG基因ASHR1在除代表四分體時期花蕾以外的花蕾中表達量均高于可育株系。原位雜交分析表明該基因在單核小孢子和雙核花粉中表達。
　　(7)通過全長擴增發(fā)現(xiàn)白菜ASH

10、R1基因座上至少可以生成5種可變剪接轉錄本，其中原始轉錄本（BrASHR1.1）表達水平顯著高于其他轉錄本。擬南芥ASHR1基因座上存在2種可變剪接轉錄本，原始轉錄本(AtASHR1.1)的表達水平與可變剪接轉錄本(AtASHR1.2)的表達水平相當。此外，通過在擬南芥中過表達AtASHR1.2，發(fā)現(xiàn)異位表達的AtASHR1.2會被剪接形成AtASHR1.1。
　　(8)ASHR1在白菜和擬南芥中的過表達沒有對花粉和種子等的發(fā)育產