白菜花粉發(fā)育相關基因BcMF11和BcMF12的克隆、表達及其功能驗證.pdf

1、蕓薹屬(Brassica)作物分布地區(qū)廣。品種資源豐富。也是雜種優(yōu)勢利用最為普遍的一類作物，發(fā)掘和創(chuàng)建其雄性不育系，用于配制一代雜種，在生產實踐中具有重要意義?；ǚ郯l(fā)育相關基因的分離及其功能分析，為深入探索向菜類等蕓薹屬作物花粉發(fā)育的分子機制提供了實驗依據(jù)，同時有助于通過反義技術等阻斷與花粉發(fā)育有關基因的表達從而獲得雄性不育植株：本研究以白菜(Brassicacampestris L.ssp．chinensis Markino，syn．

2、B．rapa ssp．chinensis)花粉轉錄組的分析中發(fā)現(xiàn)的兩個基因BcMF11(Brassica campestris male fertility gene 11)和BcMF12(Brassica campestris male fertility gene 12)作為研究對象，采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術擴增分離基因全長，分析其序列特征并預測其蛋白質結構和功能，進而采剛

3、Northern雜交和RT-PCR(reverse transcriptase polymerasechain reaction)技術分析它們在白菜不同發(fā)育階段的營養(yǎng)組織與生殖組織中的表達狀況，然后依據(jù)反義遺傳學原理，構建組成型啟動子CaMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S)和白菜絨氈層組織特異型啟動子Bc49(Brassica campestrisA9)驅動的反義BcMF11和反義BcMF12基因表達載

4、體，通過遺傳轉化獲得轉基因植株，從分子、形態(tài)和細胞學等方面對轉基因植株進行全面檢測和分析，明確它們與白菜花粉發(fā)育的關系，為全面認識花粉發(fā)育的系統(tǒng)性調控，揭示蕓薹屬作物雄性不育的分子機理奠定基礎。研究結果表明： (1)利用RACE技術從白菜野生型可育株中成功克隆劍花粉特異的BcMFll(DO925484)。該基因eDNA序列全長828 bp，多處出現(xiàn)終止密碼子，缺乏明顯的開放閱讀框，但包含poly(A)尾部結構。堿基組成分析發(fā)現(xiàn)整

5、個序列中A/T含量較高，達到58.7％。預測的RNA分子二級結構自由能非常低，只有-203.26 kcal·mol<'-1>。BLAST搜索未發(fā)現(xiàn)與其相似的基因。推測BcMF11是白菜中首次發(fā)現(xiàn)的一個新的類似于mRNA的非編碼RNA基因。該基因的上游序列區(qū)存在幾個與花粉發(fā)育密切相關的順式作用調控元件，預示BcMF11可能與花粉發(fā)育相關。 Northern雜交與RT-PCR分析表明BcMF11在白菜的花蕾、開放的花及花藥中特異表達

6、，同時其轉錄本表達量隨著花粉的發(fā)育保持緩慢增加，這說明BcMF11屬于在花粉發(fā)育過程中持續(xù)表達的花粉特異基因。 (2)根據(jù)白菜非編碼RNA基因BcMF11的全長序列設計引物，在蕓薹屬植物的10個物種中PCR擴增得到BcMF1的同源序列。序列特征分析發(fā)現(xiàn)，這些BcMF11同源基因具有非編碼RNA的共同特征，說明該非編碼RNA基因在蕓藍屬植物進化過程中核苷酸序列較保守。在序列同源比對的基礎上，基于Kimura雙參數(shù)(2-parame

7、ter)距離，構建BcMF11同源基因在蕓薹屬植物．10個物種的NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)樹。結果表明，‘黃芽14’南方大白菜與‘油青’菜心聚為一類，與北方大白菜‘小青口’處于不同的分支，推測它與北方大白菜有不同的演化過程；而北方大白菜‘小青口’和‘溫州盤菜’蕪菁以極高的支持值聚為一類(BCL值為99％)，成為它們親緣關系很近的證據(jù)之一。 (3)通過RACE方法從白菜花粉特異cDNA片段BBPl克隆到其全長基因

8、BcMF12(DQ925483)。序列特征分析表明，該基因全長1155bp，最大開放閱讀框894 bp，編碼297個氨基酸。對BcMF12編碼的蛋白質二級結構預測表明它包含60.61％的螺旋和35.69％的環(huán)狀結構?？缒^(qū)及疏水結構分析表明該蛋白含有6個保守的疏水跨膜區(qū)。經BLAST詢發(fā)現(xiàn)它與植物中已報道的兒個跨膜蛋白具有較高的相似性，因此BcMF12可能是白菜中一個新的跨膜蛋白。 Northern雜交與RT-PCR分析表明Bc

9、MF12主要在白菜野生型可育株的中大蕾和大蕾中表達，屬于花粉中特異表達的“晚”基因。 (4)在正確分離反義BcMF11和反義BcMF12片段的基礎上，分別構建了含有組成型啟動子CaMV35S和花藥絨氈層組織特異型啟動子BcA9的反義RNA植物表達載體pBi35S-BcMF11、pB135S-BcMF12、pBIBcA9-BcMF11和pBIBcA9-BcMF12，并通過“凍融法”將其導入農桿菌，根據(jù)已建立的高效白菜類作物遺傳轉化

10、體系，利用農桿菌介導的方法將反義BcMF11和反義BcMF12表達載體導入菜心(B.campestris ssp．chinensis var．parachinensis Tsen et Lee)中，成功獲得了61個Kan<'R>(kanamyein-resistant)轉基因菜心芽系及305株菜心抗性植株。 (5)對PCR篩選出的反義BcMF11和反義BcMF12轉基因菜心剛性植株進行Southern和Northern印跡雜交檢

11、測，從整合及轉錄水平證明反義基因片段已成功轉入菜心中，并有效抑制了轉基因植株中內源基因的表達。x-Gluc組織化學染色結果也說明反義BcMF11和反義BcMFl2片段在轉基因菜心植株中進行了轉錄和表達。 (6)對BcMF11反義基因菜心轉化植株花器官的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)其花絲短小，花藥不飽滿，而且部分花藥顏色褐化，花粉數(shù)量極少，甚至無粉?；ǚ坌螒B(tài)掃描電鏡觀察表明pBl35S-BcMF11和pBIBcA9-BcMF11菜心轉基因植株人

12、部分花粉表現(xiàn)畸形，畸形率分別為88.59％和91.26％，極顯著高于非轉基因對照植株花粉的畸形率。采用組織化學方法對花粉發(fā)育及其形態(tài)的細胞學觀察顯示，轉基因植株在花粉發(fā)育后期表現(xiàn)為花約癟縮變形，花粉囊萎縮，花粉內含物消火，絨氈層細胞退化，花粉表現(xiàn)敗育?；ǚ垭x體萌發(fā)試驗結果顯示，反義pBl35S-BcMF11和反義pBIBcA9-BcMF11轉基因植株的花粉萌發(fā)率分別是31.35％和37.24％，均顯著低于對照植株花粉的萌發(fā)率。由此推測，

13、BcMF11沉默將使花粉形態(tài)和內部結構發(fā)生明顯異常，最終導致花粉敗育。 (7)對反義BcMF12轉基因菜心花器官的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)其花約不飽滿，顏色發(fā)向，花粉數(shù)量少。電鏡掃描結果表明，反義pB1BcA9-BcMF12和反義pB135S-BcMF12菜心轉基因植株的花粉畸形率相差較大，分別為89.57％和23.42％；相應地，其花粉萌發(fā)率分別為38.26％和78.91％，說明BcA9啟動子對反義BcMF12在花粉中表達的調控活性較之