雞白介素18成熟蛋白突變體在畢赤酵母中的高效表達及其生物活性檢測.pdf

1、雞白介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)是新發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子,它具有廣泛的生物活性,除能夠促進γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生,刺激淋巴細胞轉化,增強NK細胞的殺傷活性,還在介導細胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達系統(tǒng)之一,該系統(tǒng)操控簡單、經(jīng)濟,表達量高,具有翻譯后修飾的能力。目前已有多種外源蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中得到成功表達。因此可用畢赤酵母表達

2、獲得高產(chǎn)量且具有生物活性的雞白介素18成熟蛋白(mature Chicken interleukin-18,mChIL-18)。本試驗首先通過引物設計來定點突變雞白介素18基因,構建成功能分泌表達雞白介素18成熟蛋白的重組表達質粒pPIC9K-mChIL-18,然后將其導入畢赤酵母GS115中。篩選多拷貝陽性子,表達mChIL-18蛋白,測定其生物活性,為mChIL-18進一步的研究與開發(fā)打下基礎。本研究的主要結果如下:
　　

3、為了得到高表達量的mChIL-18蛋白,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏嗜性,通過引物設計來定點突變雞白介素18基因。同時構建了重組質粒pPIC9K-mChIL-18。經(jīng)PCR和酶切鑒定、DNA測序得知:mChIL-18基因表達片段定向插入到表達載體啟動子下并形成正確的開放閱讀框(ORF)。
　　 用SalⅠ酶切重組質粒pPIC9K-mChIL-18,采用電轉儀將其電轉到畢赤酵母GS115中,經(jīng)G418篩選出多拷貝陽性子。在提取染色體DNA

4、之后,用特異性引物和通用引物對轉化菌株進行PCR鑒定,結果顯示擴增出了特異條帶,表明外源基因整合進了宿主細胞染色體中。將篩選的多拷貝重組菌用甲醇誘導表達蛋白。經(jīng)優(yōu)化表達條件,證明在誘導溫度為28℃,培養(yǎng)液pH值為6.5,甲醇的誘導濃度為2％,誘導時間為120 h時表達量最高,表達量約為480 mg/L。
　　 用MTT法和微量細胞病變抑制法檢測mChIL-18蛋白的生物活性。表達的mChIL-18蛋白能夠刺激SPF雞淋巴細胞大量