雞白介素18成熟蛋白突變體在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其生物活性檢測(cè).pdf

1、雞白介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,它具有廣泛的生物活性,除能夠促進(jìn)γ-干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生,刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性,還在介導(dǎo)細(xì)胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一,該系統(tǒng)操控簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),表達(dá)量高,具有翻譯后修飾的能力。目前已有多種外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。因此可用畢赤酵母表達(dá)

2、獲得高產(chǎn)量且具有生物活性的雞白介素18成熟蛋白(mature Chicken interleukin-18,mChIL-18)。本試驗(yàn)首先通過(guò)引物設(shè)計(jì)來(lái)定點(diǎn)突變雞白介素18基因,構(gòu)建成功能分泌表達(dá)雞白介素18成熟蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mChIL-18,然后將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115中。篩選多拷貝陽(yáng)性子,表達(dá)mChIL-18蛋白,測(cè)定其生物活性,為mChIL-18進(jìn)一步的研究與開發(fā)打下基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　

3、為了得到高表達(dá)量的mChIL-18蛋白,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏嗜性,通過(guò)引物設(shè)計(jì)來(lái)定點(diǎn)突變雞白介素18基因。同時(shí)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-mChIL-18。經(jīng)PCR和酶切鑒定、DNA測(cè)序得知:mChIL-18基因表達(dá)片段定向插入到表達(dá)載體啟動(dòng)子下并形成正確的開放閱讀框(ORF)。
　　 用SalⅠ酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-mChIL-18,采用電轉(zhuǎn)儀將其電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中,經(jīng)G418篩選出多拷貝陽(yáng)性子。在提取染色體DNA

4、之后,用特異性引物和通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示擴(kuò)增出了特異條帶,表明外源基因整合進(jìn)了宿主細(xì)胞染色體中。將篩選的多拷貝重組菌用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件,證明在誘導(dǎo)溫度為28℃,培養(yǎng)液pH值為6.5,甲醇的誘導(dǎo)濃度為2％,誘導(dǎo)時(shí)間為120 h時(shí)表達(dá)量最高,表達(dá)量約為480 mg/L。
　　 用MTT法和微量細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)mChIL-18蛋白的生物活性。表達(dá)的mChIL-18蛋白能夠刺激SPF雞淋巴細(xì)胞大量