重組人白介素-2（IL-2）突變體克隆及在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)與純化.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(IL-2)最初曾被稱為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，并能促使各種造血細(xì)胞增殖和分化。臨床研究表明其關(guān)鍵作用可作為T(mén)淋巴細(xì)胞激活的增殖信號(hào)，因而將IL-2用于治療艾滋病?；谄淠艽碳ぞ哂屑?xì)胞毒的，抗腫瘤細(xì)胞的能力，IL-2還用于各種癌癥的治療。目前人IL-2已經(jīng)完全用基因工程的方法生產(chǎn)，而且基因工程IL-2與天然IL-2的功能和臨床效果基本一致。 目的：近年來(lái)，雖然基因工程IL-2應(yīng)用于肝炎及某些癌癥的治療已取得令人矚目的成果

2、，但大劑量，長(zhǎng)時(shí)間用藥對(duì)病人仍然存在一定的毒副作用，如發(fā)熱，寒戰(zhàn)，惡心，嘔吐，頭暈，乏力和毛細(xì)血管滲漏綜合癥等，所以，為了提高人重組白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定性和活性以及減少毒副作用，有必要定向改造rhIL-2的分子結(jié)構(gòu)。本研究在畢赤酵母中高效表達(dá)hIL-2cDNA，獲得hIL-2蛋白，擬對(duì)天然型hIL-2進(jìn)行改構(gòu)以獲得新的突變體，同時(shí)進(jìn)行活性測(cè)定，以便深入了解hIL-2的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。方法：用PCR法從白細(xì)胞介素-2(IL-2)cDNA

3、全序列中擴(kuò)增成熟的肽基因片段，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)將人重組白細(xì)胞介素-2第125位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄校痪幋a18位亮氨酸的序列突變?yōu)榈鞍彼嵝蛄?；編碼19位亮氨酸的序列突變?yōu)榻z氨酸序列，經(jīng)限制酶酶切片段分析與DNA序列分析證明后，獲得三突變體MvhIL-2。IL-2基因片段與酵母中間載體pPIC9K融合后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F’，擴(kuò)增質(zhì)粒，獲取大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再轉(zhuǎn)化畢赤酵母，并在畢赤酵母中表

4、達(dá)突變蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)。利用IL-2依賴細(xì)胞株CTLL-2細(xì)胞對(duì)純化的突變蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)和野生型IL-2進(jìn)行測(cè)活。結(jié)果：本研究成功地構(gòu)建IL-2突變體，并在畢赤酵母中得到表達(dá)。作為一種真核生物，畢赤酵母比起其它更高級(jí)的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)有許多優(yōu)點(diǎn)：例如在蛋白加工，蛋白折疊和轉(zhuǎn)錄后修飾等方面，同時(shí)，它又和大腸桿菌或啤酒酵母一樣具有分子水平和基因水平操作容易的優(yōu)點(diǎn)，比其它真

5、核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)更快，更容易，消耗更少，而且表達(dá)水平高，有10倍到100倍表達(dá)異源蛋白的能力。這些特點(diǎn)使畢赤酵母作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)非常有用。將pPIC9K-MvhIL-2DNA用SalI酶切后，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)系統(tǒng)—畢赤氏酵母得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵，上清液用15％SDS-PAGE檢測(cè)表明有IL-2突變體的表達(dá)；經(jīng)Western-blot檢測(cè)有免疫活性。經(jīng)超濾濃縮，強(qiáng)陽(yáng)離子交換S柱和分子篩層析得到純化的MvhIL-2。

6、純化的突變蛋白對(duì)CTLL-2細(xì)胞具有刺激性；與野生型IL-2相比，在各種溫度條件下儲(chǔ)存的突變蛋白保留有更高的活性；pPIC9KMvIL-2整合到畢赤酵母中表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上，高表達(dá)得到的IL-2具有高活性。結(jié)論：人IL-2cDNA可通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，所獲得的突變型MvIL-2活性比天然型NhIL-2高5倍。所以IL-2突變體(IL-2-C125A/L18M/L19S)較野生型的IL-2具有更高的穩(wěn)定性和活性。