豬小腸抗菌肽CecropinP1在畢赤酵母中的分泌表達及其生物活性研究.pdf

1、無論是在畜牧業(yè)還是在人類醫(yī)學領域，抗生素已經成為臨床治療病原感染的有力武器。同時抗生素還可作為畜禽飼料添加劑在畜禽疾病預防和促生長方面發(fā)揮重要作用。但是，抗生素的亂用與濫用，造成了許多細菌產生耐藥性，且耐藥菌株出現的速度已遠遠超過抗生素新藥的開發(fā)速度，使抗感染治療陷入耐藥菌的危機中；抗生素作為飼料添加劑的廣泛使用，也嚴重破壞了畜禽腸道的微生物平衡，而且在畜產品體內積蓄殘留，帶來了嚴重的公共衛(wèi)生隱患。 有鑒于此，“無毒，無殘留，無

2、耐藥性”是新一代抗菌制劑的發(fā)展趨勢和要求?？咕?antibacterial pcptidcs)是生物體免疫防衛(wèi)系統產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質，是生物體先天免疫的重要組成成分(Boman，1991)。由于其獨特的抗菌機制，不會誘發(fā)細菌的耐藥性，成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?目前抗菌肽的制備主要有生物材料提取、化學合成和基因工程表達3種方法?？咕脑谏锝M織中含量低，且分離程序煩瑣，獲得的樣品

3、僅僅用于氨基酸序列分析和初步的抗菌試驗，難以滿足應用需要；化學合成法合成差錯隨著目的肽段的增大而增加(一般超過50個氨基酸殘基的肽段難以用化學合成法合成)，并且其合成價格昂貴；基因工程方法是目前大量表達抗菌肽使其成為新一代肽類抗菌藥物更為現實的途徑，顯示出其廣闊的前景。多種抗菌肽已在不同的表達體系中得到表達，如天然抗菌肽天蠶素A和B已在昆蟲系統中得到表達；柞蠶抗菌肽D和綠蠅抗菌肽在酵母系統中得到表達；天蠶抗菌肽A在真核系統中得到表達等等

4、。本研究的目的就是應用基因工程和蛋白質工程技術研究豬小腸抗菌肽cccropin P1及其體內外抗菌活性，為重組抗菌肽cecropin P1的工程化生產和畜牧養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生健康奠定基礎。本研究主要從以下幾個方面展開。 1、選用畢赤酵母偏好密碼子設計并人工合成豬小腸抗菌肽cecropin P1基因，全長117bp?；騈端引入a-交配信號肽kex 2裂解位點，以保證表達抗菌肽具有天然N端；C端引入谷氨酰胺增加抗菌肽的酰氨化程度，以

5、增強廣譜抗菌活性。此外，基因的兩端分別引入兩個限制性酶切位點Xho Ⅰ和Xba Ⅰ?？咕幕虮豢寺∪雙PICZa-A質粒，成功構建了分泌型重組酵母表達載體pPICZa-A-cecP1。將重組質粒Sac Ⅰ線性化后電擊轉化Pichia pastoris SMD1168。在AOX1(醇氧化酶)啟動子調控下，類似天然抗菌肽大小的目的蛋白獲得分泌表達。初步抑菌活性測定顯示其對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Cowan Ⅰ)、鼠傷寒沙門氏菌和枯

6、草芽孢桿菌具有很強的抑殺活性。 2、SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，僅存部分蛋白酶B活性，這樣非常有利于發(fā)酵液中重組抗菌肽表達物的穩(wěn)定。筆者對cecropin P1重組酵母菌的搖瓶發(fā)酵條件進行了表達優(yōu)化和生物學活性研究，結果顯示當含有重組酵母菌的BMGY培養(yǎng)液OD600達到7～8時轉接pH值為6.0 BMMY培養(yǎng)基，每24h補加0.5％甲醇，并于28℃培養(yǎng)72h后，抗菌肽cecropin P1可獲得高效表

7、達。根據瓊脂孔擴散法，對重組抗菌肽的酸、堿、熱穩(wěn)定性和抑菌效價等生物學特性進行檢測。 3、以昆明種小鼠為對象，初步研究了重組抗菌肽cecropin P1防治小鼠細菌感染的效果。通過預試驗，確定了選用的金黃色葡萄球菌(Cowan Ⅰ)和致病性大腸桿菌K99對小鼠的最小致死劑量(MLD<,100>)和抗菌肽體內保護劑量的參考值。在預防實驗中，腹腔注射cecropin P1重組抗菌肽240μg的小鼠，2h后分別腹腔注射致死劑量金黃色