豬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因在畢赤酵母中的表達研究.pdf

1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種具有多種生物學活性的細胞因子。GM-CSF對機體炎癥，腫瘤以及其他一些疾病都有較好的抑制或輔助治療作用，同時還具有明顯的免疫增強作用，具有很好的應用前景。研究具有生物學活性的GM-CSF蛋白的體外表達具有重要意義。本研究開展了豬GM-CSF(pGM-CSF)基因畢赤酵母體外表達研究。
　　 1、畢赤酵母表達載體pPIC9K-pGM的構建研究
　　 針對含有pGM-CSF全

2、部編碼區(qū)基因的載體19T-GM設計一對引物，擴增出pGM-CSF去信號肽的成熟編碼區(qū)基因，大小為384bp; pGM-CSF基因插入pMD19-T Simple Vector，成功構建pMD19-T-pGM克隆質粒；pMD19-T-pGM經(jīng)EcoR I和Ⅳot I雙酶切后，回收pGM-CSF基因，插入經(jīng)相同雙酶切處理的載體pPIC9K中，構建畢赤酵母表達載體pPIC9K-pGM，對pPIC9K-pGM進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，結果表明

3、成功構建pPIC9K-pGM表達載體。
　　 2、GS115/pPIC9K-pGM重組菌的篩選
　　 將pPIC9K-pGM經(jīng)Sac I線性化再乙醇沉淀回收，電轉化畢赤酵母宿主菌GS115感受態(tài)細胞，接種于YPD平板上，在30℃培養(yǎng)3d，培養(yǎng)基長出乳白色菌落，表明pPIC9K-pGM重組子轉化成功；重組子進行G418/YPD濃度梯度篩選，結果在4mg/mL的G418/YPD培養(yǎng)基上獲得高拷貝重組子；將高拷貝重組子進行表型

4、鑒定篩選，成功篩選到Mut+型高拷貝重組子；將Mut+型高拷貝重組子進行PCR擴增，擴增出預期的384bp片段，表明重組子篩選正確，并將此高拷貝重組菌命名為GS115/pPIC9K-pGM。
　　 3、GS115/pPIC9K-pGM重組菌在畢赤酵母中表達
　　 將GS115/pPIC9K-pGM于BMGY培養(yǎng)基中激活培養(yǎng)至OD600達2.0～2.5時收集菌體，BMMY培養(yǎng)基調至OD600=1.0，于30℃，300r/m

5、的空氣培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)表達，同時每24h添加甲醇一次，使其終濃度為1％(v/v)。將表達產(chǎn)物進行間接ELISA和SDS-PAGE檢測，結果表明pGM-CSF獲得表達，表達蛋白的分子量約為18kD，且表達最佳時間為4d。將表達蛋白進行western-bloting分析，結果表達蛋白能與pGM-CSF陽性血清特異性結合，表明產(chǎn)物具有反應原性。將表達的pGM-CSF蛋白過濾除菌后進行TF-1細胞增殖試驗，該蛋白具有促進TF-1細胞增殖的能力，且