普通小麥春化基因的克隆及表達特性分析.pdf

1、小麥的春化特性是決定小麥種植區(qū)劃、引種用種及栽培技術(shù)的重要因素之一，小麥品種冬春性的強弱直接影響到小麥的穗分化進程及其對低溫凍害的耐受能力，開展小麥春化分子調(diào)控機理的研究具有重要的理論和實踐意義。本研究以具有不同春化特性的9個代表性小麥品種為試驗材料，系統(tǒng)分析了它們的發(fā)育特性、春化基因組成及表達特性，主要研究結(jié)果如下： 1、小麥春化基因VRN1的組成與春化發(fā)育特性。 在供試的9個品種中，低溫春化處理在不同程度上均可縮短小

2、麥的幼穗分化進程和苗穗期，且小麥品種的春性越強，其對低溫的敏感性越低，冬性越強則對低溫春化的敏感性越高。在不同低溫春化處理條件下，遼春10號（Vrn-A1，Vrn-B1，Vrn-D1）和新春2號（Vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在5％以下，為春性品種，遼春10號的春性最強；豫麥18（vrn-A1，vrn-B1，Vrn-D1）和鄭麥9023（vrn-A1，Vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在5％～10％

3、以下，為弱春性品種；周麥18（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）和豫麥49-198（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在20％～24％之間，為半冬性品種；京841（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1新冬18（vrn-A1，Vrn-B1，vrn-D1）和肥麥（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在25％～32％之間，為冬性品種，肥麥的冬性最強。通過基因組特異性PCR鑒定及序列分析

4、，小麥品種的春化發(fā)育特性與春化基因Vrn1勺顯隱性組成密切相關(guān)，當(dāng)Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1均為顯性時，品種的春化發(fā)育特性為強春性，低溫春化效應(yīng)極低；當(dāng)Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1為隱性時，品種的春化發(fā)育特性為半冬性到強冬性，低溫春化效應(yīng)從弱到強；當(dāng)Vrn-A1或Vrn-B1或Vrn-D1為顯性時，品種的春化發(fā)育特性為春性，Vrn1顯性基因的春性效應(yīng)表現(xiàn)為Vrn-A1> Vrn-B1>Vrn-D1的趨勢，與品種

5、的春性強弱趨勢表現(xiàn)一致。 2、小麥春化基因VRN1的克隆和表達特性。 通過PCR特異擴增技術(shù)克隆了春化基因VRN1的cDNA片段，序列分析顯示該基因的A、B和D等位基因間有差異，B和D基因組差異較小，A基因組與B和D基因組差異較大；VRN1基因在不同品種間差異較小，其序列有較高的保守性。通過特異性半定量RT-PCR技術(shù)對VRN1的三個等位基因的表達特性分析顯示，強春性品種（遼春10號）的3個等位基因在1葉期（圓錐期）就有

6、較低水平的表達，從3葉期（二棱期）開始保持高水平表達至開花期；春性品種新春2號、弱春性品種豫麥18和鄭麥9023中，均有一個顯性等位基因（分別為Vrn-A1、Vrn-D1和VRN-B1）在1葉期（圓錐期）就啟動表達，而另外兩個等位基因的表達則較滯后，這與其基因組成（分別為Vrn-A1vrn-B1 vrn-D1、vrn-A1 vrn-B1 Vrn-D1和vrn-A1 Vrn-B1vrn-D1）相一致；在半冬性（周麥18和豫麥49-198）

7、和冬性品種（京841和肥麥）中，三個等位基因均對低溫春化高度敏感，低溫春化的誘導(dǎo)效應(yīng)具有vrn-A1>vrn-B1>vrn-D1的趨勢。結(jié)果表明，VRN1基因的表達啟動與等位基因的顯隱性組成密切相關(guān)，顯性等位基因的表達啟動較早，而隱性等位基因則較滯后；低溫春化能夠誘導(dǎo)VRN1的表達；在通過春化階段后VRN1維持高水平的表達，并一直持續(xù)至開花期。 3、小麥春化基因VRN2的克隆和表達特性。 通過PCR特異擴增技術(shù)克隆了春化

8、基因VRN2的兩個成員ZCCT1和ZCCT2，序列分析顯示該基因可編碼包含CCT結(jié)構(gòu)域的功能蛋白，基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因包含1個1249bp～1449 bp的內(nèi)含子。表達特性分析顯示，在強春性品種遼春10號中未檢測到其表達；在春性品種新春2號、弱春性品種豫麥18和鄭麥9023中，只有1葉期（圓錐期）有表達；在其它檢測的半冬性和冬性品種中，VRN2基因的表達與VRN1的表達互為消長，即在通過春化階段以前表達，而在通過春階段后則停止表達，

9、停止表達時間與幼穗發(fā)育通過二棱期一致；VRN2基因的表達受低溫春化的抑制，因此在普通小麥中，不需要春化（強春性品種）或當(dāng)春化發(fā)育階段（春性、冬性品種）通過時，該基因即不表達或表達量極低。 4、小麥春化基因VRN3的序列特征和表達特性。 對VRN3基因的克隆和序列分析顯示，該基因在普通小麥中至少存在3個成員：其cDNA序列分析顯示該基因編碼的蛋白屬于磷脂結(jié)合蛋白（phospholipid-binding proteins）

10、家族成員，基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，該基因包含2個內(nèi)含子，且內(nèi)含子序列在品種間存在較大差異。通過特異性半定量RT-PCR技術(shù)對VRN3的表達特性分析顯示，VRN3的表達特性有三種類型：即在圓錐期表達起始（遼春10號和豫麥18）；在伸長期或單棱期開始表達（新春2號、鄭麥9023、京841和新冬18）；在二棱期之后起始表達（周麥18和豫麥49-198和肥麥）。結(jié)果表明，所有品種VRN3的表達持續(xù)至開花期：低溫誘導(dǎo)能夠誘導(dǎo)或增強小麥VRN3的表達

11、 5、小麥春化基因的時空表達特性。 VRN1在小麥根、莖稈、葉片、花藥、胚珠、發(fā)育過程的種子中均有不同水平的表達，而在干種子和種子萌發(fā)過程中不表達，不過在冬性品種中該基因的表達特性受春化進程的影響。VRN2的表達與小麥的春化進程密切相關(guān)，僅在小麥通過二棱期前的葉片中表達，而在其它發(fā)育時期的葉片及其它組織中均未檢測到其表達；VRN3的表達除了在根系中未檢測到外，其時空表達特性與VRN1相似。 從三個春化相關(guān)基因的表達

12、特性來看，VRN1基因隨小麥發(fā)育進程及低溫誘導(dǎo)而表達，冬性越強，促進表達所需要低溫誘導(dǎo)的時間越長；VRN3的表達滯后于VRN1的表達，并與VRN1有相同的表達趨勢；VRN2基因在強春性品種中不表達，其它品種僅在幼穗分化通過二棱期前有較高水平的表達，二棱期后不管是冬性品種還是春性品種，該基因均不表達，而VRN1和VRN3均有較高水平的表達；推斷VRN1和VRN3基因是生殖生長階段或開花過程必須的基因，其表達產(chǎn)物在生殖生長中起重要作用。

13、 本研究的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在： （1）首次明確了我國不同小麥生態(tài)區(qū)代表品種的VRN1基因的顯隱性組成，及不同品種中3個春化基因VRN1、VRN2、VRN3的表達特性與小麥春化發(fā)育特性的對應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三個顯性Vrn1等位基因具有春性累加效應(yīng)，而且春性特性表現(xiàn)為Vrn-A1>Vrn-B1>Vrn-D1，是控制小麥春性強弱的分子基礎(chǔ)。 （2）明確了不同品種間3個春化基因VRN1、VRN2和VRN3基因序列的差異特征，發(fā)現(xiàn)VR

14、N1基因編碼區(qū)具有較高的保守性，在不同基因組和品種間VRN1序列差異主要在內(nèi)含子區(qū)，內(nèi)含子區(qū)差異是進一步開發(fā)春化發(fā)育的分子標(biāo)記和品種特性鑒定的關(guān)鍵。 （3）進一步明確了普通小麥中3個春化基因互作機理，顯性Vrn1控制春性發(fā)育特性，隱性vrn1控制冬性發(fā)育特性，VRN1和VRN3基因是生殖生長階段或開花過程必需的基因，其表達產(chǎn)物在生殖生長中起重要作用；顯性Vrn-A1不受VRN2的抑制表達較早，隱性vrn1的表達受VRN2的抑制，