水生拉恩氏菌HX2細菌素合成相關基因分析和皺褶假單胞菌P94初步研究.pdf

1、Rahnella aquatilis HX2產生細菌素，對多種植物病原細菌具有平板抑制效果，具有較廣泛的抑菌譜；溫室和大田實驗顯示HX2菌株對由A.vitis K308引起的葡萄根癌病有較好的防治效果。本研究在前人研究的基礎上系統(tǒng)研究了HX2細菌素合成相關基因及細菌素在HX2防治葡萄根癌病生防機理中的作用。
　　 通過Tn5插入突變獲得兩株不產生細菌素的突變體MH15和MH16，Southern雜交表明Tn5在MH15和MH16

2、中都是單拷貝插入。Tn5插入引起HX2細菌素產生性狀缺失，并對菌株的生長也發(fā)生了影響，兩個突變體在生長曲線的對數(shù)生長期與野生菌株沒有差異，但穩(wěn)定期明顯長于野生菌株，使得突變體菌落直徑在生長40 h后約為野生菌株的兩倍。
　　 構建了HX2基因組文庫。利用鳥槍法和反向PCR法分別通過突變體MH15和MH16中克隆到了Tn5插入的側翼序列，通過側翼序列設計引物對構建的基因組文庫進行篩選，將篩選到的陽性粘粒通過三親雜交驗證功能表明篩選

3、到的陽性粘粒都能互補突變體，使突變體產生細菌素的能力得到恢復。將獲得的陽性粘粒進行亞克隆獲得2400 bp的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)可以互補突變體MH16。從陽性粘粒中獲得一個輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇(包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF六個PQQ合成基因(長5374 bp)和一個1038 bp的未知功能的閱讀框ORF-X)可以互補突變體MH15。構建了gdh基因缺失載體，HX2的gdh基因缺失菌株

4、HX2Δgdh細菌素產生的性狀同時缺失。構建了gdh和Pqq基因互補載體，通過三親雜交轉入突變體后都能使突變體產生細菌素的性狀得到恢復，并且突變體生長性狀也恢復到了野生菌的水平。將PQQ以0.01μM加入到培養(yǎng)基中也可以使MH15產生細菌素和生長的性狀恢復到野生菌HX2水平。這些結果表明gdh基因和Pqq基因簇與HX2細菌素合成有關。
　　 溫室檢測突變體和互補菌株在向日葵和葡萄上對A.vitis引起的根癌病的防治效果，實驗結果

5、表明，不產生細菌素的菌株(MH15、MH16)在向日葵上對根癌病的防效為28.8～33.3％，在葡萄上對根癌病的防效為77.4～82.1％，產生細菌素的菌株(HX2、CH15、CH16和MH15+PQQ)在向日葵和葡萄上對根癌病的防效沒有差異，為92.3～100％；大田防效檢測結果表明，產素缺失突變體對葡萄根癌病的防效由野生菌株(HX2)的80.2％下降到了45.1％(MH15)和55.7％(MH16)；產素缺失突變體在葡萄上對A.vi

6、tis K308引起的根癌病的防效要優(yōu)于在向日葵上對其的防效。這些結果表明細菌素在HX2生防機理中占有重要作用，但并不是其唯一機理。
　　 從北京地區(qū)土壤中分離出628株細菌，從中篩選出10株對番茄灰霉病菌有拮抗作用的細菌，其中P94的拮抗能力最強。生防菌株P94的抑菌譜實驗結果表明P94對多種植物病原細菌和病原真菌有抑制作用。P94在向日葵、番茄和煙草上無致病性。通過Biolog鑒定系統(tǒng)，16S rDNA序列測定，生理生化特征