小麥K型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系蛋白質(zhì)組差異研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)是一種廣泛存在于高等植物中的生物學(xué)現(xiàn)象,因其雄性生殖系統(tǒng)不能產(chǎn)生有功能的花粉,而雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)生長完全正常的特點(diǎn),使其在雜交制種中免去了“去雄”的繁瑣步驟,已成為作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。關(guān)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的內(nèi)在機(jī)理仍需更進(jìn)一步的研究。迄今為止,已從生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等方面細(xì)胞質(zhì)雄性不育開展了相關(guān)研究,但蛋白質(zhì)表達(dá)方面的研究還較少。

2、>　　 本研究利用改進(jìn)的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù),從發(fā)育遺傳學(xué)的角度,對小麥K型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的不同器官及不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)相關(guān)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行了差異分析。結(jié)果如下:
　　 1.以小麥處于二核-三核期的花藥為材料,比較了三種不同蛋白質(zhì)提取方法三氯乙酸/丙酮法、尿素/硫脲法、KCl-醋酸銨甲醇法對雙向電泳結(jié)果的影響,并在蛋白質(zhì)裂解液組成、蛋白質(zhì)上樣量等方面進(jìn)行了探索與優(yōu)化。結(jié)果表明,與尿素/硫脲法及KCl-醋酸銨甲醇法相比,采

3、用三氯乙酸/丙酮法提取蛋白質(zhì)操作簡便,所得的雙向電泳圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多,蛋白點(diǎn)形狀規(guī)則、清晰,且重復(fù)性好,圖譜背景也比較清晰。樣品溶解于含有硫脲的蛋白質(zhì)裂解液Ⅱ中,可顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性。以三氯乙酸/丙酮提取法提取小麥花藥中的蛋白,用蛋白質(zhì)裂解液[7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4％(W/V)CHAPS,1％(V/V)pH=3～10的固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)buffer]溶解蛋白,以

4、pH3～7線性24cm的IPG膠條進(jìn)行雙向凝膠電泳,在上樣量為1000μg,12％SDS-PAGE膠濃度下,蛋白質(zhì)得到了更好的分離,圖譜效果最好。
　　 2.利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù),構(gòu)建小麥K型不育系豫麥21和豫農(nóng)43及其保持系的苗期葉片和二核-三核期旗葉的蛋白圖譜。發(fā)現(xiàn)不育系與保持系凝膠上的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜基本相同,只有豫農(nóng)43不育系與保持系有3個(gè)蛋白點(diǎn)存在差異。
　　 3.通過對花藥蛋白的雙向電泳分析,構(gòu)建小麥K型

5、不育系豫麥21和豫農(nóng)43與其保持系處于二核-三核期花藥的蛋白圖譜。結(jié)果表明,大部分蛋白質(zhì)屬于酸性蛋白,主要集中分布在pH4～7區(qū)域內(nèi),有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同親和階段表現(xiàn)差異,其中在豫農(nóng)43不育系與保持系之間發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異點(diǎn):A4、A5、A6、A7、A8。A5是僅在豫農(nóng)43保持系花藥中表達(dá)的點(diǎn)；點(diǎn)A4、A6、A8僅在豫農(nóng)43不育系花藥中表達(dá)；點(diǎn)A7在豫農(nóng)43保持系花藥中上調(diào)表達(dá),而在不育系中下調(diào)表達(dá)。在豫麥21不育系與保持系之間發(fā)現(xiàn)Bl、B

6、2、B3、B4、B5、B6、B7,一共7個(gè)差異點(diǎn),從圖中可以看出這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)大部分為量上面的差別。其中,B1和B7在豫麥21不育系花藥中表達(dá)上調(diào),而在保持系中下調(diào)表達(dá)；點(diǎn)B2、B3、B4、B5、B6在豫麥21不育系花藥中表達(dá)下調(diào),在保持系中表達(dá)上調(diào)。
　　 4.利用二級質(zhì)譜肽(LC/ESI—MS/MS)和蛋白數(shù)據(jù)庫分析鑒定差異蛋白,共鑒定15個(gè)蛋白點(diǎn),其中10個(gè)得到成功鑒定。分別代表6種不同的蛋白,即:OEC33kD蛋