玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系microRNA克隆與功能分析.pdf

1、microRNA（簡稱miRNA）作為真核生物體內(nèi)的一類負(fù)調(diào)控因子，在生物體內(nèi)所起的調(diào)節(jié)作用幾乎涉及到所有的細(xì)胞水平。從2002年首次發(fā)現(xiàn)植物miRNA以來，在短短六年時間里關(guān)于植物miRNA方面的研究報(bào)道層出不窮，但是迄今為止在各物種中所鑒定的miRNA數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及理論上的飽和值，而對miRNA相關(guān)功能研究更是該領(lǐng)域面臨的一大挑戰(zhàn)。作為非模式植物的玉米，在miRNA方面的研究自然落后于擬南芥和水稻，目前僅僅有96條玉米miRNA序列

2、被登陸到miRNA數(shù)據(jù)庫中。因此玉米miRNA的分離鑒定及功能分析在今后的很長一段時間內(nèi)依然將是該領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。本研究將玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系C48-2及其保持系N48-2作為研究對象，通過組織分離克隆的方法鑒定在花藥中表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步對這些miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，并結(jié)合miRNA在不育系和保持系之間的表達(dá)差異和靶基因的相關(guān)功能分析，初步推斷這些miRNA與玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育特性之間的關(guān)系。現(xiàn)將本研究的結(jié)果小結(jié)

3、如下： 1．克隆獲得了81條大小在18～26bp的小分子RNA，主要富集在20～24bp范圍內(nèi)，去除tRNA、rRNA以及降解序列之后，通過mfold分析序列在基因組上是否形成符合miRNA前體標(biāo)準(zhǔn)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果得到10條符合標(biāo)準(zhǔn)的序列。 2．這10條序列的長度在21～24nt范圍內(nèi)，且其中5’端第一個核苷酸為“U”的有5條，這些特點(diǎn)和其它已鑒定的植物miRNA一致。進(jìn)一步對它們進(jìn)行物種間保守性分析發(fā)現(xiàn)，其中6條在水稻

4、、小麥和擬南芥中存在不同程度的保守性，總體趨勢表現(xiàn)為在單子葉水稻和小麥中的保守性高于雙子葉植物擬南芥。 3．通過加尾-引物延伸RT-PCR法，對以上10條候選miRNA在C48-2和N48-2花藥中的表達(dá)進(jìn)行真實(shí)性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們在兩個材料的花藥均有表達(dá)，證明了這10個miRNA是真實(shí)存在的，將其鑒定為新的玉米miRNA，歸屬于10個新的miRNA家族。 4．通過miRU植物miRNA靶基因預(yù)測軟件和CSRDB、NCB

5、I數(shù)據(jù)庫以及Pfam氨基酸功能域分析軟件，預(yù)測到其中9個miRNA作用的10靶序列。在這些靶序列中，有3個是包括MADS-box在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，3個屬于花藥代謝過程中的關(guān)鍵酶，分別是NADH脫氫酶、細(xì)胞色素單P450單加氧酶和二氫黃酮醇-4-還原酶，1個為22KD的α-醇溶蛋白，2個分別是某種不確定的膜內(nèi)在蛋白和具備抗氧化作用的特殊分子伴侶，另外一個功能不明。在這些靶基因中，NADH脫氫酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶和二氫黃酮醇-4-還原

6、酶已經(jīng)被證明參與花藥的能量代謝和物質(zhì)代謝過程，并與植物雄性不育有著緊密聯(lián)系；而MADS-box基因則是近年來被受關(guān)注的一類與植物育性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。 5．用實(shí)時熒光定量PCR法對這10個miRNA在C48-2和N48-2不同發(fā)育時期花藥中的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在四分體期，10個miRNA在兩個材料之間表達(dá)量均存在顯著差異，表現(xiàn)為在C48-2中的表達(dá)量低于N48-2。此外，其中3個miRNA的表達(dá)量在兩個材料的單核期也表現(xiàn)出

7、明顯差異，miR-1在C48-2中的表達(dá)量低于N48-2，而miR-6和miR-10與之相反。 6．結(jié)合miRNA在不育系、保持系間的表達(dá)量和其靶基因的相關(guān)功能分析，對miRNA調(diào)控與花藥發(fā)育以及玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育之間的關(guān)系有了初步的認(rèn)識，總結(jié)如下： 第一，從四分體期到單核期，可育材料中10個miRNA的下調(diào)表達(dá)可能是花藥正常發(fā)育的重要條件，也可能是花藥正常發(fā)育后產(chǎn)生的結(jié)果，而miRNA在可育材料中有規(guī)律的時序性表達(dá)，證

8、明了miRNA參與了花藥發(fā)育的調(diào)控。 第二，miR-1、miR-2和miR-6在四分體時期與單核期可育系和保持系中的表達(dá)量均存在明顯差異，暗示著這3個miRNA在四分體時期和單核期都參與了雄性敗育過程。而miR-3、miR-4、miR-5、miR-7、miR-8、miR-9、miR-10對雄性不育的調(diào)控在單核期的表現(xiàn)得更明顯一些。 第三，miRNA調(diào)控可能是引起不育的原因：miRNA在不育系中的異常表達(dá)導(dǎo)致了花藥代謝過程