龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究以龍眼(DimocarpuslonganLour.)“紅核子”品種LC2胚性細(xì)胞系為材料，進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其同步化調(diào)控，獲取體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中各個(gè)主要發(fā)育階段的培養(yǎng)物，進(jìn)行如下研究：①采用雙向電泳分析龍眼體胚發(fā)生過程中特異表達(dá)的蛋白；②分離純化體細(xì)胞胚胎發(fā)育后期特異表達(dá)的小肽；③進(jìn)行小肽的肽質(zhì)量指紋圖譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，并用RT-PCR的方法克隆相關(guān)基因；④分析影響龍眼體胚小肽表達(dá)的因素。主要研究結(jié)果如下： 1.龍眼體

2、胚發(fā)生過程中特異表達(dá)蛋白的雙向電泳分析。龍眼胚性愈傷組織、球形胚、子葉胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚總蛋白的雙向電泳分析表明：①龍眼胚性愈傷組織中pI值在4～5之間的酸性蛋白表達(dá)種類最多，在體胚發(fā)育的過程中逐漸消失，相反，pI值在5～6之間的微酸性蛋白的表達(dá)逐漸增多；②體胚發(fā)育后期，尤其是成熟胚晚期，分子量大的蛋白大量減少，分子量較小的蛋白增多并逐漸積累；③雖然在各個(gè)發(fā)育階段都會(huì)出現(xiàn)一些新的特異蛋白，但是沒有改變蛋白質(zhì)種類逐漸減

3、小的趨勢(shì)；④發(fā)現(xiàn)了一些有差異的特異蛋白點(diǎn)，尤其是成熟胚后期，有一系列大分子量的蛋白消失，新出現(xiàn)了一部分分子量較小的蛋白，其中幾種表達(dá)量很大，可能與體胚發(fā)育有密切關(guān)系，可供以后繼續(xù)深入研究。 2.龍眼體胚發(fā)生過程中特異表達(dá)小分子多肽的分離純化與鑒定。龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生各個(gè)主要發(fā)育階段(胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚、成熟胚)總蛋白的SDS-PAGE分析表明：成熟胚階段出現(xiàn)的特異表達(dá)的小分子多肽，分子量在14.4kD以

4、下。除龍眼之外，如此小分子量的特異蛋白在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育的研究中尚未有報(bào)道。經(jīng)典的SDS-PAGE的方法對(duì)分子量在15kD以下的小分子多肽分辨率不大。采用改進(jìn)的Tricine-SDS-PAGE的方法分離龍眼體胚發(fā)生后期的小肽，得到較好的分離純化效果，小肽的分子量約在7.4kD左右。切下膠條首先做肽質(zhì)量指紋圖譜(MALDI-TOF)分析，無法確定是何種類型小肽；進(jìn)一步做串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF)分析，結(jié)果中有一個(gè)八肽的片段(AISTEKSK

5、)與一種熱帶魚(Roeboidesmagdalenae)的ATP合成酶亞基8的肽段中的一段吻合，而且分子量接近，因此推測(cè)此小肽可能是龍眼的ATP合成酶亞基8蛋白(ATPase8)。 3.龍眼胚性愈傷組織ATP合成酶亞基8基因(atp8)的cDNA克隆及其在體胚中的表達(dá)規(guī)律。根據(jù)GenBank中已公布的雙子葉植物atp8基因的序列，設(shè)計(jì)了正義、反義引物，用RT-PCR的方法克隆出313bp的核酸片段，克隆測(cè)序，與其他已知序列的雙子

6、葉植物同源性可達(dá)90％以上，但翻譯出的氨基酸序列卻沒有包括“AISTEKSK”八肽的片段。因?yàn)橹参锞€粒體基因組的表達(dá)有編輯現(xiàn)象，會(huì)影響到翻譯的準(zhǔn)確性，因此不能確定小肽與atp8基因是否對(duì)應(yīng)。RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，atp8基因在胚性愈傷組織、子葉胚和成熟胚中的表達(dá)量基本相同。鑒于數(shù)據(jù)庫(kù)中有限的信息和分析技術(shù)的限制，此小肽的功能尚無法確定。 4.影響龍眼體胚小肽表達(dá)的因素分析。研究小肽的表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn)，小肽從成熟胚早期就有，但表達(dá)

7、量較小，隨著成熟時(shí)間的增加，表達(dá)量越來越大；適當(dāng)增加培養(yǎng)基的滲透壓能使小肽的表達(dá)量增加。體胚在成熟的過程中處于高滲透壓環(huán)境中，脫去細(xì)胞內(nèi)大量的水分，因此小肽的功能有幾種可能：①與細(xì)胞在高度失水狀態(tài)下維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)有關(guān)；②是細(xì)胞內(nèi)作為將來供胚胎萌發(fā)用的營(yíng)養(yǎng)和能量來源的貯藏蛋白；③為細(xì)胞分裂生長(zhǎng)和胞內(nèi)物質(zhì)合成提供能量的能量轉(zhuǎn)化的功能蛋白，如ATP合成酶。ATP8亞基蛋白是ATP合成酶F0部分的一個(gè)組成部分，是跨膜蛋白，和其他的幾個(gè)亞