香果樹體細胞胚胎發(fā)生及形態(tài)建成機理的研究.pdf

1、本研究以香果樹的未成熟種子為外植體，通過固體和液體懸浮培養(yǎng)技術，對影響香果樹體細胞胚胎發(fā)生的多種培養(yǎng)因子進行篩選，建立了穩(wěn)定的香果樹體細胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)體系；通過不定芽直接再生和愈傷組織誘導香果樹器官發(fā)生兩種途徑，建立了香果樹快速高頻率發(fā)生的植株再生體系。并從組織細胞學、同工酶酶譜以及遺傳變異等方面，對香果樹體細胞胚胎形態(tài)建成的機理進行研究，結果表明： 1、以香果樹葉片為外植體在添加1.0mg/L6-BA和1.0mg/L2,4-

2、D的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)產生愈傷的頻率為100％，愈傷組織在添加0.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基中分化得到不定芽，分化頻率為94.35％，平均每塊愈傷產生再生芽1.95個。將香果樹葉片培養(yǎng)在添加6-BA或ZT的MS培養(yǎng)基中，不經過愈傷的分化階段，直接不定芽的誘導頻率達到100％。在2.0mg/L6-BA作用下，培養(yǎng)40d后平均每個外植體產生再生芽（芽高=5mm）的數目達到15個；在1.0mg/LZT作用下，培

3、養(yǎng)40d后平均每個外植體產生再生芽（芽高<5mm）的數目達到56.67個/cm2。黑暗預培養(yǎng)有利于香果樹葉片外植體芽的再生。兩種途徑得到的再生植株轉到1/2MS培養(yǎng)基上均可生根，生根率達100％，并且添加1.0mg/L的IBA和0.5％的活性炭有利于再生植株根的生長。小苗移栽到溫室95％能夠存活。 2、香果樹的未成熟種子在MS+6-BA2.0mg/L+3％蔗糖的固體培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率達100％；將愈傷組織轉接到附加6-BA和

4、NAA不同組合的MS固體培養(yǎng)基上可誘導體細胞胚的形成，其中在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+3％蔗糖培養(yǎng)基上誘導率可達100％，可以得到不同時期的體細胞胚，并且體細胞胚增殖快，生成的子葉胚也比較多。 3、懸浮培養(yǎng)條件下，最適的接種量為2％（鮮重）；較適合的基本培養(yǎng)基為MS；1％的蔗糖濃度容易使球形胚聚合體愈傷化，3％和6％的蔗糖濃度適合球形胚聚合體增殖，9％的蔗糖容易使球形胚聚合體褐化；添加0.5mg/L6-

5、BA和0.5mg/LNAA的MS液體培養(yǎng)基，當初始蔗糖濃度為3％，然后逐步提高蔗糖濃度到6％有利于香果樹各個發(fā)育階段的同步化；子葉胚轉到不含任何植物生長調節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基上，可以長成正常植株。 4、石蠟切片觀察表明，香果樹體細胞胚胎發(fā)生于胚性愈傷組織中的一個或多個原始細胞組成的原胚，原胚經球形胚、心形胚、魚雷胚發(fā)育成子葉胚。組織化學染色觀察結果表明，香果樹體細胞胚胎發(fā)生過程中的淀粉積累僅發(fā)生在由愈傷組織向胚性愈傷組織轉變的過

6、程中，原胚和球形胚時期胚體外包被富含淀粉的細胞層，從心形胚時期開始，淀粉細胞層解體消失，僅在胚柄端保留淀粉細胞層以提供胚體細胞分裂和生長所需要的物質和能量。 5、用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術（PAGE）對香果樹體細胞胚胎形態(tài)建成過程中過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、淀粉酶（AMY）和超氧化物歧化酶（SOD）四種同工酶進行分析。結果表明：香果樹體細胞胚胎形態(tài)建成過程中，POD、EST、AMY和SOD活性變化與胚性愈傷組織的

7、誘導及體胚的發(fā)育密切相關。非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織和體細胞胚之間，酶譜差異明顯。 6、用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分子標記方法，從DNA水平上分析野生型香果樹以及通過器官發(fā)生途徑和體細胞胚胎發(fā)生途徑得到的香果樹再生植株以及體細胞胚胎發(fā)生過程中不同繼代次數的胚性愈傷組織之間的遺傳變異。篩選了100個隨機引物，其中有75條隨機引物能夠擴增出條帶，從中選取11個引物進行PCR擴增的結果顯示：香果樹體細胞胚胎無性系中有RAPD