椪柑體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的初步研究.pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)在植物快繁、種質(zhì)資源保存、遺傳轉(zhuǎn)化、基因工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。已有研究表明，體細(xì)胞胚胎發(fā)生與氧化脅迫、DNA甲基化狀態(tài)等有密切關(guān)系。迄今，椪柑體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理與分子機(jī)理尚不清楚?；诖?，本論文以椪柑胚性愈傷組織為起始材料進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，分析該過(guò)程中其可溶性蛋白含量、三種抗氧化酶活力和活性氧水平的動(dòng)態(tài)變化，以期了解抗氧化系統(tǒng)在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的作用;利用已公布的甜橙基因組數(shù)據(jù)，鑒定NADPH氧化

2、酶基因家族成員，分析它們?cè)跅崭腆w細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)情況，以期篩選出與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的特異NADPH氧化酶基因;采用MSAP技術(shù)分析椪柑體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中DNA甲基化水平和模式變化，以期初步揭示其表觀(guān)變化規(guī)律。主要研究結(jié)果如下:
　　1.選取椪柑體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中四個(gè)階段的培養(yǎng)物:即剛接種的胚性愈傷組織(EI0)，轉(zhuǎn)成黃色的胚性愈傷組織(EI1)，肉眼可見(jiàn)的胚狀體(EI2)和出現(xiàn)50％以上的胚狀體(EI3)，進(jìn)行可溶性蛋白含量、

3、H2O2水平及抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活力的測(cè)定。結(jié)果表明:可溶性蛋白含量先下降后逐漸升高;過(guò)氧化氫含量先逐漸上升后下降;從EI0到EI2過(guò)程三種酶活力都表現(xiàn)出先升高后下降的變化規(guī)律，但在EI2到EI3過(guò)程，POD、CAT活力下降，SOD活力則升高。
　　2.采用生物信息學(xué)方法在柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出13個(gè)柑橘NADPH氧化酶基因，并分析這些基因在椪柑體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，四個(gè)階段共檢測(cè)到8個(gè)基因（C

4、sRboh1、CsRboh2、CsRboh5、CsRboh6、CsRboh7、CsRboh10、CsRboh11和CsRboh12）的表達(dá)，且變化趨勢(shì)有明顯差異;未檢出表達(dá)的基因是CsRboh3、CsRboh4、CsRboh8、CsRboh9和CsRboh11。其中CsRboh7基因在EI2和EI3表達(dá)。
　　3.采用MSAP技術(shù)研究椪柑體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中DNA甲基化水平和模式的變化。結(jié)果表明，椪柑體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中DNA甲基化整