桑細(xì)菌性枯萎病病原學(xué)及其致病機(jī)理研究.pdf

1、從2006夏，在浙江省臨安、桐廬等地的桑園發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重的桑樹(shù)細(xì)菌性新病害--桑樹(shù)細(xì)菌性枯萎病，造成了嚴(yán)重的損失。本研究通過(guò)對(duì)引發(fā)病害的病原及其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行深入探討。在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)了由腸桿菌引起桑樹(shù)“枯萎”的新證據(jù)。研究通過(guò)柯赫氏法則、多重鑒定方法證明了引起病害的病原菌為陰溝腸桿菌群Enterobacter cloacae complex。并通過(guò)對(duì)桑細(xì)菌枯萎病菌導(dǎo)入綠色熒光蛋白基因的方法，觀察了病原菌在植物體內(nèi)的分布規(guī)律；應(yīng)用脂肪酸特征

2、、基因間重復(fù)序列多態(tài)性和特殊基因序列遺傳多態(tài)性的比較，分析了病原菌的群體多態(tài)性特征。取得了以下主要研究結(jié)果：
　　 (1)從浙江省臨安和桐廬發(fā)的病重區(qū)分3次采樣共33份，分離到病原細(xì)菌98株。采用水培扦插和桑樹(shù)盆栽苗接種的方法對(duì)選取的6株代表性菌株的致病性測(cè)定表明，各菌都能單獨(dú)引起桑樹(shù)枝條產(chǎn)生葉片黃化、枯萎、落葉和枝條頂端壞死癥狀，能引起桑樹(shù)盆栽苗產(chǎn)生枯萎和維管束褐變癥狀，為典型的桑樹(shù)細(xì)菌性枯萎病病原菌。6株代表菌株經(jīng)經(jīng)典細(xì)菌學(xué)

3、、Biolog和脂肪酸鑒定為腸桿菌屬Enterobacter spp.；16S rDNA序列分析將6個(gè)菌株歸入序列相似性都高于97％的3個(gè)腸桿菌種中；最后通過(guò)rpoB基因序列分析將6個(gè)菌株分別定位到陰溝腸桿菌(E. cloacae)，阿氏腸桿菌（Easburiae）和一個(gè)新種（Enterobacter sp.），均屬于陰溝腸桿菌組群。
　　 (2)用電擊轉(zhuǎn)化的方法將帶有綠色熒光蛋白和熒光素酶gfp/luxAB雙標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座載體

4、整合到?？菸≡璄nterobacter sp. R18-2中，篩選到一個(gè)高效表達(dá)GFP的標(biāo)記菌R18-gfp-1。R18-gfp-1通過(guò)gfp基因的特異性引物擴(kuò)增，菌落形態(tài)的觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)菌體大小、形狀及熒光的表達(dá)量，以及16S rDNA序列分析證明的確為R18-2的衍生菌。外源基因的導(dǎo)入并不影響菌株的生長(zhǎng)，而且標(biāo)記菌的熒光表達(dá)量穩(wěn)定，證明gfp基因是整合在標(biāo)記菌的基因組染色體上的。接種實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)記菌和原始菌對(duì)桑樹(shù)和番茄組織培

5、養(yǎng)苗都具有致病能力，但是標(biāo)記菌引起的桑樹(shù)苗“枯萎”發(fā)病癥狀比對(duì)照晚了5-6天，表明外源基因的表達(dá)削弱了菌株的致病力表現(xiàn)，但是不影響菌株在寄主體內(nèi)的定位增殖。共聚焦熒光顯微鏡觀察R18-gfp-1在植物根、莖、葉組織分布的情況表明，病原菌接種3天后，除了接種位點(diǎn)外，細(xì)菌最早在根部生長(zhǎng)點(diǎn)和皮層的薄壁細(xì)胞中可觀察到，接種5天后，植物根莖的導(dǎo)管細(xì)胞可以清楚的觀察到大量發(fā)綠色熒光菌體的分布，但是植株葉片上檢測(cè)不到菌體的分布情況，推測(cè)病原菌引起植物

6、上部出現(xiàn)枯萎，可能是由于細(xì)菌堵塞導(dǎo)管，引起植物水分缺乏所致。
　　 (3)50株桑枯萎病腸桿菌組多態(tài)性分析結(jié)果表明，引起桑樹(shù)枯萎病的陰溝腸桿菌組群具有豐富的種群和基因遺傳多態(tài)性，通過(guò)Hsp60基因、ERIC-PCR和BOX-PCR序列多態(tài)性和rpoB基因序列聚類分為10個(gè)基因群，但是它們的多重遺傳結(jié)構(gòu)與病原菌致病能力和致病范圍多態(tài)性之間不存在相關(guān)性。2種基因間重復(fù)序列擴(kuò)增多態(tài)性( ERIC-PCR，BOX-PCR)和2個(gè)特殊基因

7、(Hsp60，rpoB)多態(tài)性都和菌株的來(lái)源相關(guān)，但是與菌株間的脂肪酸類型和致病能力方面不存在相關(guān)性。表明了控制腸桿菌細(xì)胞脂肪酸類型的基因和控制病原菌致病相關(guān)基因可能不存在于腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列和BOX元件中，而控制細(xì)菌熱休克蛋白的基因和編碼RNA聚合酶β亞基的基因也與編碼細(xì)胞脂肪酸類型和致病性基因沒(méi)有直接關(guān)系。但是這4種基因遺傳多態(tài)性的研究可對(duì)腸桿菌的種下分化鑒定和推測(cè)病原菌的來(lái)源及其病害的傳播流行趨勢(shì)起到指導(dǎo)性作用。