作物枯萎病生防細(xì)菌的研究.pdf

1、枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，該病的生物防治己受到世界各國(guó)的極大關(guān)注。為獲得優(yōu)良性狀生防菌直接為生產(chǎn)服務(wù)，本論文從菌種篩選鑒定、抑菌機(jī)理、安全性、發(fā)酵條件、定殖狀況、抑菌物質(zhì)分離提純等方面對(duì)枯萎病的生防細(xì)菌進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。 以番茄枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp．radicis lycopersici)為靶標(biāo)菌，通過(guò)平板拮抗和溫室盆栽防效相結(jié)合的方法從不同來(lái)源的土壤中篩選具有生防潛力的芽

2、孢桿菌。從分離到的169株芽孢桿菌中篩選出具有拮抗作用的菌株15個(gè)，其中JK-2菌株對(duì)番茄枯萎病的盆栽防效和田間防效分別達(dá)到83.82％和74.70％，抑菌能力最強(qiáng)。通過(guò)生理生化特征和16S rDNA序列比較、脂肪酸(FAME)分析， JK-2菌株被鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。電鏡觀察結(jié)果表明，JK-2主要通過(guò)拮抗作用來(lái)抑制枯萎病菌在番茄根部的侵染。JK-2可造成枯萎病菌菌絲消解、產(chǎn)生泡狀物、破壞生長(zhǎng)

3、點(diǎn)、引起細(xì)胞內(nèi)含物外溢及降低孢子萌發(fā)率。JK-2對(duì)寄主植物沒(méi)有致病性；對(duì)小向鼠的半致死量LD<,50>>2000mg·kg<'-1>：接種JK-2菌株30d后，番茄根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的變化均未達(dá)到極顯著水平，而真菌數(shù)量明顯下降，初步表明了該菌株安全性較高，符合生物殺菌劑的要求。通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)獲得的最適宜JK-2抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)酵配方為：淀粉1.0％、牛肉膏0.5％、蛋白胨0.3％、蔗糖1.0％、酵母粉0.5％，CaCl<,2>

4、0.5％，初始pH7.0。JK-2產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)粗提物對(duì)蛋白酶不敏感，耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿，紫外線和反復(fù)凍融對(duì)其活性也沒(méi)有顯著影響。在定殖試驗(yàn)中成功獲得了具GFP標(biāo)記和紅霉素抗性的轉(zhuǎn)化子JK-2-gfp，JK-2-gfp菌株可通過(guò)灌根接種的方法在自然土壤中成功定殖，其在土壤中的含量為10<'4>-10<'6>cfu/g，接種60天后仍可在土壤中分離到JK-2-gfp菌株。本試驗(yàn)從JK-2發(fā)酵液中提取出了分子量約為4.1kD的活性肽和具有抑制枯萎菌

5、活性的胞外多糖，短短芽孢桿菌產(chǎn)生對(duì)病原真菌具拮抗活性的多糖物質(zhì)在國(guó)內(nèi)外尚屬首次報(bào)道。 本研究同時(shí)對(duì)福建漳州香蕉植株的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離和拮抗細(xì)菌的篩選。首次在國(guó)內(nèi)開展了香蕉健康植株和罹患枯萎病植株中內(nèi)生細(xì)菌分布規(guī)律的比較研究。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，健株體內(nèi)細(xì)菌總量顯著高于病株；健株中除地下球莖、葉柄部位的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與病株相比不存在顯著差異外，其余各部位的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均顯著高丁病株；健株和病株內(nèi)生細(xì)菌在種群數(shù)量分布上存在差異；分離到

6、的16個(gè)內(nèi)生細(xì)菌種群中，在健株中沒(méi)有分離劍巨人芽孢桿菌(B.megaterium)，而在病株中沒(méi)有分離到Acinetobacter baumannii和Microbacterium chocolatum。從分離到的4ll株香蕉內(nèi)生細(xì)菌中篩選出35株對(duì)尖孢鐮刀菌香蕉?；?F oxysporum f．sp．cubense)具有抑制作用的拮抗細(xì)菌，占供試菌株總數(shù)的8.52％。最后篩選到的8株能夠產(chǎn)生穩(wěn)定抑菌圈的菌株中有6株分離自健康植株，經(jīng)

7、鑒定有5株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、2株為惡臭假單胞菌(p.putida)、1株為生枝動(dòng)膠菌(Zoogloea ramigera)，其中銅綠假單胞菌H4-3-1菌株抑菌活性最強(qiáng)。抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果表明H4-3-1菌株對(duì)番茄、香蕉、西瓜、甜瓜、辣椒枯萎病病原菌、番茄灰霉菌、油菜菌核菌等均有良好的離體拮抗效果。電鏡觀察結(jié)果表明，H4-3-1菌株能使番茄枯萎菌菌絲扭曲變形、細(xì)胞壁破裂、糾集成團(tuán)停止生長(zhǎng)，但對(duì)孢

8、子萌發(fā)的抑制作用不大。H4-3-1菌株代謝產(chǎn)物可顯著促進(jìn)胚軸和根的生長(zhǎng)，在盆栽試驗(yàn)中，H4-3-1菌懸液對(duì)番茄出苗具有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)番茄苗株高、根長(zhǎng)和鮮重也有不同程度的促進(jìn)作用。由于H4-3-1菌株菌體數(shù)量與抑菌活性不呈正相關(guān)，需考慮實(shí)際需要來(lái)選擇發(fā)酵條件，其中抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)條件為：NA培養(yǎng)液初始pH為7.0，裝液量25ml/250ml三角瓶，30℃下振蕩培養(yǎng)24h。H4-3-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以被飽和度為70％的硫酸銨